重組腺病毒構(gòu)建，擴(kuò)增及純化基本技術(shù)操作

（細(xì)菌內(nèi)同源重組AdEasy System）

一 目的基因的克隆（以pshuttle-CMV質(zhì)粒為例）

1.      選擇適當(dāng)酶切位點(diǎn)，進(jìn)行酶切連接，將目的片段插入pshuttl-CMV質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)。

2.      重組質(zhì)粒鑒定： 酶切鑒定或測(cè)序。

3.      重組質(zhì)粒擴(kuò)增，純化并準(zhǔn)備適量含目的基因的穿梭質(zhì)粒。

4.      用PmeI單酶切線性化重組穿梭質(zhì)粒，電泳鑒定質(zhì)粒完全被切開。

5.      膠回收線性化質(zhì)粒，以備共轉(zhuǎn)化使用。

二 共轉(zhuǎn)化

1  大腸桿菌BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備

²       從新鮮瓊脂板上挑取單個(gè)BJ5183細(xì)菌，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振搖過夜。

²       接種25ml過夜培養(yǎng)物于500ml LB培養(yǎng)基，37℃振搖，至OD₆₀₀ 達(dá)到0.4。

²       迅速將培養(yǎng)物置于冰浴中30min，至充分冷卻。

²       將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，4℃下以2500r/min離心15 min，棄培養(yǎng)液，回收細(xì)胞。

²       以10ml預(yù)冷的10%甘油洗滌沉淀，低溫離心，共兩次。

²       加約1ml（適量）預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀，稀釋懸液100倍，測(cè)量OD_600，至稀釋濃度為2-3×10¹⁰個(gè)細(xì)胞/ ml （1.0 OD₆₀₀約2.5×10¹⁰個(gè)細(xì)胞/ml）。分裝，-80℃或液氮保存待用。

2  病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，擴(kuò)增，純化。

3  將1-5µl （約1µg） 線性化的穿梭質(zhì)粒及1µl（約100ng/µl）病毒骨架質(zhì)粒（如pAdEasy-1）加入至含約40µl BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)的EP管中混勻,冰上冷卻。

4  將混合物加入電轉(zhuǎn)杯，電擊（1250-1500V/mm,5ms）。

5  電擊結(jié)束取出樣品，加入1ml SOC或LB培養(yǎng)液，37℃低速振蕩40min。

6  取適當(dāng)體積的電擊轉(zhuǎn)化細(xì)胞液涂于數(shù)個(gè)卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培養(yǎng)16-20hr。

7  次日挑取平板上長出的菌落（選擇*小的菌落）,接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)10-15hr。

8  堿裂法提取質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質(zhì)粒為可能陽性克隆，進(jìn)一步酶切鑒定。以PacI單酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段（約30kb）,及一條小片段（約3.0或4.5kb）（同時(shí)可進(jìn)行其它酶切鑒定），則基本確定為陽性克隆。

9  取1-5µl 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌細(xì)胞（BJ5183為recA+,質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變，DH5α或JM109，XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株，可穩(wěn)定擴(kuò)增已鑒定的重組質(zhì)粒），擴(kuò)增細(xì)菌并純化質(zhì)粒。

三 重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)293細(xì)胞

1  293細(xì)胞培養(yǎng)：轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時(shí)前，以方瓶為例，接種2×10⁶  293細(xì)胞于25cm²方瓶，使生長密度約50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）

2  以PacI單酶切重組病毒質(zhì)粒（轉(zhuǎn)導(dǎo)25cm²方瓶約需4µgDNA），完全線性化后，乙醇沉淀，再以20 µl ddH₂O溶解。

3  脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒（以Lipofectamine為例）:每4µg PacI約需20µl Lipofectamine包裹.質(zhì)粒及脂質(zhì)體分別稀釋于500µl無血清培養(yǎng)基再混合,置于室溫下15-30min。

4  以無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌培養(yǎng)瓶，另加2.5ml無血清培養(yǎng)基，37℃放置10min。

5  將Lipofectamine-DNA混合物加入培養(yǎng)瓶，37℃孵箱放置4hr。

6  4hr后，棄Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FCS）。如有大量細(xì)胞漂浮，可不棄Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基，37℃孵育過夜，再換液。

7  培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞生長情況。約2周后可觀察到細(xì)胞病變（CPE）出現(xiàn)（如用pAdTrack-CMV質(zhì)粒，由于含GFP，可觀察到綠色熒光）。

四 重組病毒鑒定

1  轉(zhuǎn)導(dǎo)10-14d后，收集細(xì)胞沉淀，加入2ml滅菌的PBS混懸，凍融細(xì)胞，離心后收集上清保存于-80℃。

2  取30-50% 步驟1中上清，感染50-70%飽和度的25cm²方瓶中293細(xì)胞。2-3d后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變。

3  感染后3-5d,當(dāng)1/3-1/2細(xì)胞漂浮時(shí)收集病毒。按步驟1收集細(xì)胞并準(zhǔn)備病毒上清。通過Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產(chǎn)生。

4  PCR鑒定重組病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，離心后取1-2µl作PCR。

五 重組病毒擴(kuò)增，純化

1  75cm²方瓶中接種293細(xì)胞，至密度達(dá)到90%，加入適量病毒上清感染細(xì)胞。3-4d后，細(xì)胞幾乎變圓，且有一半細(xì)胞漂浮，則收集所有細(xì)胞。約500g轉(zhuǎn)速離心，棄上清。

2  以滅菌PBS重懸沉淀，反復(fù)凍融4次。4℃下7000g離心5min.病毒純化至少需要30瓶75cm²方瓶細(xì)胞。

3  CsCl連續(xù)梯度離心純化：50ml離心管中稱量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混勻，體積約為10ml。轉(zhuǎn)移至12ml超速離心管（用于SW41轉(zhuǎn)頭）中，覆蓋約2ml礦物油。平衡后，10℃下32000 rpm離心18-24hr，用注射器抽吸離心出的病毒帶。

（也可CsCl不連續(xù)梯度離心：20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 （53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9），上面小心加入6 mL CsCl 1.2 （26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9），再小心加入病毒上清液至體積達(dá)到20ml。平衡后，4℃下 23000rpm離心90min （SW28轉(zhuǎn)頭），用注射器抽吸下層藍(lán)白色病毒帶）

4  病毒透析去鹽：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl₂, 5% sucrose），滅菌處理。4℃透析，更換3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。

六 病毒滴度測(cè)定（TCID50）

1  細(xì)胞準(zhǔn)備:96孔板中接種100µl 293細(xì)胞,每孔細(xì)胞數(shù)約10⁴個(gè),以2% DMEM培養(yǎng)

2  稀釋病毒液準(zhǔn)備：以2% DMEM將病毒液稀釋成8個(gè)較高濃度（如10^-3-10^-10），每個(gè)濃度重復(fù)10個(gè)，每孔加入病毒稀釋液100µl。另留兩排不加病毒液作為陰性對(duì)照。37℃下，孵箱培養(yǎng)10天。

3  10d后觀察細(xì)胞，記數(shù)每排出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，計(jì)算細(xì)胞病變率。（如某一濃度各孔細(xì)胞全部病變，比率為1，如無細(xì)胞病變，則比率為0）。

4  計(jì)算T =10×10^{1 + d （S - 0.5）} /ml

d = Log 10 稀釋度（如為10倍稀釋℃，d=1）

   S = 各濃℃細(xì)胞病變比率之和

實(shí)驗(yàn)室重組腺病毒常用質(zhì)粒：病毒骨架質(zhì)粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2

穿梭質(zhì)粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司