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上海恒遠(yuǎn)講述細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

點擊次數(shù)：15195 發(fā)布時間：2013/3/29 11:32:29

1. 細(xì)胞培養(yǎng)（HEK293T）
1）顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，去上清；
2）加入預(yù)熱的PBS 3ml, 溫柔地清洗細(xì)胞,棄去PBS；
3）用胰蛋白酶消化細(xì)胞，通常75cm2 培養(yǎng)瓶的貼壁細(xì)胞用3ml 胰蛋白酶于37oC
處理5min；
4）待細(xì)胞脫落后，加入5ml DMEM 培養(yǎng)液（含10%FBS）以終止消化反應(yīng)，并將
細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入15ml 或50ml 離心管中；
5） 1000rpm 離心5min，去除上清；
6）加入10ml DMEM 培養(yǎng)液（含10%FBS），重新懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞充分打散；
7）進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),（4 個大方格細(xì)胞數(shù)的均值×104 個為每ml 所含細(xì)胞數(shù)）；
8）根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，將適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)接入含有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶
或皿中；（第二天做轉(zhuǎn)染，A.Fugene6 法－－細(xì)胞總量應(yīng)達(dá)4-5×106 /10cm 培養(yǎng)
皿; B. 磷酸鈣法: 細(xì)胞總量應(yīng)達(dá)3×106 / 10cm 培養(yǎng)皿）；
9）置于37 ℃ 5％CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) （注意培養(yǎng)箱應(yīng)有足夠的水分）。
注：以上所使用的胰蛋白酶、培養(yǎng)液等在使用前都置于37℃水浴中預(yù)熱，以減
小對細(xì)胞的刺激。
2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
2.1 脂質(zhì)體介導(dǎo)的貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染法
以下針對293T 細(xì)胞、10cm 培養(yǎng)皿
目前主要使用試劑盒為Roche 公司的FuGENETM6 Transfection Reagent
1）轉(zhuǎn)染前24 小時以4-5×106 /10cm 培養(yǎng)皿的細(xì)胞總量鋪板，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)