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點擊次數:15128 發布時間:2017/1/18 9:56:02
能夠應用ELISA 實驗的樣本種類很多,有血清,血漿,細胞裂解液,細胞培養上清,尿液,肺泡灌洗液,腦脊液,各種組織勻漿等,每種樣本采集和處理的方式都不相同。上海恒遠市場部通過文獻、試劑盒說明書和網友的經驗,整理出*新以下方法僅供參考。
一、 血清:
1.采血后室溫靜置20min或更長時間至血清析出。
2.將采集的血液用離心機4℃,2000rpm離心15min左右,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。
3.取上清并分裝保存備用,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
大部分ELISA檢測試劑盒均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,以HRP為標記的 ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。此外還應避免細菌污染,因為菌體中可能含有含有內源性HRP,也會產生假陽性反應。血清標本宜在新鮮時檢測。如在冰箱中保存過久,在間接法ELISA中可使本底加深。
二、血漿:
1.取血后加入抗凝劑(EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉等),混合10-20分鐘后,30分鐘內于冰上分離血漿以減少血小板的污染(也可以直接用抗凝管采集)。
2.將采集血液用離心機4℃,2000rpm離心15min左右,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。
3.取上清并分裝保存備用,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
注意事項:制備血漿標本需借助于抗凝劑EDTA,抗凝不完全的標本因纖維蛋白原干擾而造成假陽性。請注意指標說明書上對于抗凝血劑是否有特殊要求,建議使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等于血清。
三、尿液
1.采集尿液樣本500ul,加入無菌試管中。
2.用離心機4℃,2000rpm離心15min左右,將離心好的樣本小心收集上清,棄下面沉淀。
3.取上清并分裝保存備用,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
四、細胞培養上清:
1.用無菌試管收集細胞培養上清液。
2.用離心機4℃,2000rpm離心15min左右,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。
3.取上清并分裝保存備用,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
五、細胞裂解液
1.取細胞培養板或細胞懸液,用PBS(PH7.2-7.4)洗滌細胞培養板1-2次。
2.通過反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑(裂解液),使細胞破壞并放出細胞內成份。
3.用離心機4℃,2000rpm離心20min左右,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。
4.取上清并分裝保存備用,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
六、組織勻漿:
1.采集組織,在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱重,剔除附屬的結締組織,稱取組織塊。
2.用移液管量取0.1M PBS或者用0.86%冷生理鹽水,勻漿介質或生理鹽水的體積總量應該是組織塊重量的9倍,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(天熱時操作要在冰水浴中進行,將盛有組織的小燒杯放入冰水中)。
3.勻漿的方式有多種:
a) 手工勻漿:將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中,再將剩余的1/3勻漿介質或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊,一起倒入勻漿管中進行勻漿,左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉動研磨數十次(6~8分鐘),充分研碎,使組織勻漿化。
b) 機器勻漿:用組織搗碎機10000~15000r/min上下研磨制成10%組織勻漿,也可用內切式組織勻漿機制備(勻漿時間10秒/次,間隙30秒,連續3~5次,在冰水中進行),皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。
c) 超聲粉碎:用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產超聲波發生儀,用40安培,5秒/次,間隙10秒反復3~5次。
4.將制備好的10%勻漿用離心機4℃,3000rpm離心15min,將離心好的勻漿小心收集上清,棄下面沉淀。
5.取上清并分裝保存備用,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。
保存時間:
一般ELISA檢測樣本在2-8℃下,可放置保存24-48小時;-20℃下,可放置保存1個月;-70℃下,可放置保存6個月。
儲存及有效期:
1)未開封的試劑盒:所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意,收到試劑盒后請盡快將標準品、檢測溶液A、檢測溶液B以及96孔板保存于-20℃。
2)使用后的試劑盒:剩余試劑仍需按照試劑瓶標簽所示的溫度保存,開封后的酶標板要加干燥劑后密封保于-20℃,避免潮濕。
溫馨提示:試劑盒內酶標條可拆卸,按實驗需求可分多次使用;使用后的剩余試劑盒建議在首次實驗后1個月內使用完畢。產品過期時間以盒子上的標簽為準,保質期內所有組分都確保是穩定的。
原創作者:上海恒遠生物技術發展有限公司