IMD對缺血-再灌注心肌保護ATP敏感性鉀通道的作用研究
衛雷 成尚霖 馬捷

【摘要】目的 觀察心肌缺血期處理后在體大鼠心肌缺血- 再灌注損傷中中介素(Intermedin IMD) 參與情況下的保護機制 ； 研究IMD對心肌細胞的保護作用是否途經ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)，為探討心肌保護機制提供臨床思路。方法 選取標準SD 大鼠45 只，隨機分為缺血再灌注組(I/R 組)、IMD 治療組(IMD 組)、格列本脲+IMD 治療組(Gli+IMD 組)，每組15 只。各組分別于再灌注末期分別抽取動脈血3ml，用比色法測定血清CK 和LDH，用ELISA 法測cTnI活性。取心尖部心肌組織，10% 甲醛液固定，石蠟包埋，后在光鏡下觀察心肌損害程度。結果 IMD 組與I/R 組比較，P <0.01 ； Gli+IMD 組與I/R 組、IMD組比較，P <0.05。結論 IMD在心血管系統中具有保護作用且其機制可能與其激活了ATP敏感性鉀通道相關。

【關鍵詞】ATP 敏感性鉀通道；缺血再灌注；IMD；心肌保護 doi:10.3969/j.issn.1673-5552.2011.22.0010
【中圖分類號】R364.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1673-5552(2011)22-0021-02


缺血性心臟病(IHD) 已成為西方國家人口死亡的重要原因， 在我國已經上升至人口死亡原因的第二位[1]。關于IHD 的治療首先是恢復血液灌注，其目的在于解除組織的缺氧和營養物質供應不足的狀態，以阻止缺血性損傷的發展或促使其恢復[2]。在對缺血再灌注(Ischemia-reperfusion injury I/R) 損傷的機制研究中，中介素(Intermedin IMD) 也稱腎上腺髓質素2(ADM-2)，是 2003 年至今新近確認的降鈣素基因相關肽超家族成員，廣泛表達于嚙齒類動物大腦、垂體、腎臟、心臟、肺臟、胃腸道、卵巢，血管內皮細胞[3]。IMD 同家族成員如ADM和CGRP具有多種生物學效應，對多個器官系統有調節作用，已被諸多文獻證實具有很強的心血管保護作用。IMD 是一種新的內源性抗損傷保護物質，可能作為心血管疾病防治的新靶點[4,5]。因此，IMD 在心肌缺血再灌注損傷中的保護作用及其機制值得進一步研究。

1材料與方法
1.1實驗動物
選用雄性SD大鼠45 只，體重240-300g( 由山西醫科大學實驗動物中心提供)，在常規條件下飼養，普通飲食，自由飲水。
1.2藥品、試劑和儀器
IMD( 美國Phoenix 公司)、格列本脲( 上海研域化學試劑有限公司)，cTnI 試劑盒(Biosource 公司)，乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK) 試劑盒( 上海恒遠生化試劑有限公司) ；微型動物呼吸機( 浙江醫科大學醫療儀器實驗廠) ；心電圖機( 上海奧爾科特生物科技有限公司)。
1.3I/R 模型的制備
大鼠稱重后以20% 烏拉坦溶液(4ml/kg) 腹腔注射麻醉，仰臥固定，將心電圖針狀電極插入大鼠四肢皮下，描記肢體Ⅱ導聯心電圖。常規左側胸前區備皮，頸正中切開皮膚，鈍性分離頸前肌，氣管切開置管，連接微型動物呼吸機控制呼吸 ；分離出右頸總動脈，用于插管采集血液樣本。沿胸骨左緣第4、5 肋間順勢剪開心包，充分暴露心臟及左心室表面血管，以左冠狀動脈前降支(LAD) 為標志，在左心耳根部下方0.3-0.4cm 處進針，6/0 絲線( 結扎線) 穿過心肌組織在肺動脈圓錐旁出針，結扎線兩端分別套入絲線環作為再灌注拉線，收緊結扎線使左冠脈前降支閉塞30min，以造成心肌缺血。成功標志為 ：心電圖ST 段弓背向上抬


作者單位：030001 太原，山西醫科大學第二醫院心胸外科
作者簡介：衛雷(1985-)，男，碩士學歷。Email：ownfight@163.com通訊作者：馬捷

高和結扎線以下血管支配區表面顏色由正常變蒼白再變青紫示為心肌缺血。牽拉再灌注拉線使結扎線放松后恢復血流即行再灌注2h，造成I/R 模型。
1.4分組及給藥方法
大鼠分組 ：缺血再灌注組、IMD 治療組、格列本脲+IMD 治療組三組。試驗給藥 ：(I/R) 組即MI 后5min靜滴生理鹽水至實驗結束 ；(IMD組)即MI后5min 給予IMD 0.1nmol/kg，加入生理鹽水250ml靜滴至實驗結束 ；(Gli+IMD組)即MI后5min 給予IMD 0.1nmol/kg 加入生理鹽水250ml同時加入格列本脲10μmol/L 靜滴至實驗結束。給藥滴速均控制在0.5ml/min。
1.5檢測及觀察
各組在造模時分別抽取動脈血3ml至于抗凝離心管中，用2000r/min 離心10min，取上清液，用ELISA 法測cTnI，用比色法測定血清CK 和LDH 活性。
心肌HE病理組織學染色 ：實驗完畢后取心尖部約100mg 心肌組織，吸水紙脫水固定，常規石蠟包埋，連續切片，從各組中取10 張石蠟切片，二甲苯透明處理，免疫組化HE 染色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察心肌細胞形態變化。
1.6統計學分析
實驗數據以均數± 標準差( ±s)表示，統計學檢驗應用SPSS16.0 統計軟件對實驗數據進行分析，各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t 檢驗，P <0.05 為有統計學意義。

2結果
2.1各組血清心肌酶比較
與I/R組比較，IMD 組的cTnI、LDH、CK 均下降(P <0.01)； 與IMD組比較，Gli+IMD 組的cTnI、LDH、CK均升高(P <0.05)。見表1：


組別 n LDH(U/L) CK(U/L) cTnI(μg/L) I/R 組 15 982.56±83.24 96.16±8.74 1246.06±82.74
IMD 組 15 456.60±54.32▲ 60.32±5.51▲ 879.09±53.20▲
Gli+IMD 組 15 678.33±34.51★ 79.59±6.50★ 1038.05±63.65★
IMD 組與I/R 組比較，各指標▲ P <0.01 ； Gli+IMD 組與I/R 組比較，各指標★
P <0.05；Gli+IMD 組與IMD 組比較，★ P <0.05

2.2各組心肌形態學改變
光鏡下I/R組主要表現為胞漿嗜酸性變性，可見廣泛大面積呈紅染，心肌橫紋不清甚至消失，心肌纖維呈波浪狀或斷裂融合，

22 基礎研究 中國醫療前沿 2011年11月 第6卷 第22期 National Medical Frontiers of China, Nov.2011, Vol.6 No.22


肌漿多為不規則粗顆粒，有明顯細胞壞死表現，間質可見充血、水腫、出血以及嗜中性粒細胞浸潤 ；IMD 組心肌組織細胞胞核大小分布均勻, 胞漿嗜酸性變，心肌纖維輕度拉長、變細，偶見成纖維細胞及炎細胞浸潤 ；Gli+IMD 組心肌纖維拉長明顯，心肌纖維呈波浪狀、排列紊亂不規則，心肌間質出現大量炎細胞浸潤。

3討論
IMD 抑制I/R 損傷是一個復雜的病理過程，自由基生成增多和細胞內鈣超載是I/R損傷發病的主要機制[6]，文獻報道ADM可通過抑制氧化應激和降低鈣超載以拮抗心肌I/R損傷且實驗觀察到IMD1-53 再灌注具有與ADM相似的減少缺血心肌脂質過氧化終產物生成的效應[7,8]。研究表明，自發性高血壓大鼠左心室IMDmRNA 表達明顯升高，推測IMD 的表達增高是由于氧化應激導致[9]。
ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitive potassium channel， KATP) 是受細胞內ATP 濃度調控的一種內向整流鉀通道，正常情況下處于關閉狀態，在組織缺血、缺氧或能量耗竭時被大量激活。近年來研究發現，KATP 通道的激活可調節細胞缺血、缺氧反應，介導并參與細胞或組織器官的保護作用，它可能是心肌保護效應的一個共同通路、啟動因子或終末效應器，KATP 的開放能減少線粒體內鈣釋放、維持缺血/ 低氧后線體粒的穩定性，延緩或減輕缺血/ 低氧后的細胞凋亡[10]。
宋君秋等[11] 研究表明IMD具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用，其機制可能與增加抗凋亡蛋白表達和降低氧化應激損傷減少線粒體釋放細胞色素C到胞漿，抑制線粒體途徑介導的心肌細胞凋亡有關。齊永芬[12] 通過試驗總結出IMD通過抑制ERS和氧化應激改善心肌I/R 損傷。綜上諸多研究發現，IMD 在保護細胞損傷、抑制凋亡、減輕氧化應激等方面有著突出的優勢。研究證實， IMD可通過減少局部活性氧(ROS) 的含量減輕心臟缺血再灌注損傷[13]。IMD 通過G蛋白的介導對門控K+ 通道進行調節，也是其發揮效應的一種方式[14]。這在IMD 的擴血管及調節心肌收縮等方面有重要作用。
研究通過對大鼠心肌缺血再灌注損傷造模觀察心肌肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH) 及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)，檢測三組血清心肌損傷指標含量評定心肌缺血損傷的程度。結果顯示，在IMD 干預后，IMD 組較I/R 組的CK、LDH 及cTnI 含量降低，鏡下心肌壞死的損傷病變輕微，提示IMD 可減輕心肌細胞的I/R 性損傷，證實其具有心肌保護效應。同時用格列苯脲+IMD 干預I/R，結果顯示Gli+IMD 組較IMD 組的LDH、CK 及cTnI 血清含量升高，鏡下心肌壞死較為明顯，提示格列苯脲取消了IMD 的保護作用，進一步表明心肌KATP 通道參與了IMD 的心肌細胞保護效應，為臨床研究心肌細胞缺血再灌注損傷的作用機制提供重要實驗依據。此外，研究還提示， Gli+IMD 組較I/R 組的LDH、CK 及cTnI 血清含量降低，說明格列苯脲雖然一定程度上阻斷了IMD 對I/R 心肌細胞損傷的保護效應，但其心肌保護作用并沒有完全被阻斷，表明IMD 對I/R 心肌細胞損傷的保護效應可能還存在其它機制，諸如通過激活其受體系統和cAMP、NO 途徑等發揮作用[15]，還有待進一步深入研究。
可見，IMD在心肌細胞缺血再灌注損傷中對參與激活ATP 敏感性鉀通道有一定的關聯，它具有心肌細胞保護作用，深入研究對于防治心血管疾病具有重要意義。

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