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抗體效價(jià)的檢測(cè)、抗體的純化你了解多少嗎?

點(diǎn)擊次數(shù):15029   發(fā)布時(shí)間:2019/4/26 10:49:01

抗體:機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下,由B細(xì)胞分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。免疫球蛋白英文縮寫為Ig.

抗體的效價(jià):指抗體的物理狀態(tài)及其在體內(nèi)的滯留時(shí)間,以其與抗原反應(yīng)的多少來(lái)表示其免疫效果。

抗體效價(jià)的檢測(cè)(一般用ELISA間接法進(jìn)行檢測(cè))
1)2個(gè)參照:陰性參照為預(yù)取血血清,均以1抗起始濃度稀釋;陽(yáng)性參照為以前陽(yáng)性血清或者細(xì)胞上清
2)于96空板中每孔適量的抗原,邊沿孔應(yīng)盡量避免使用,會(huì)降低細(xì)光值,影響結(jié)果。于4℃過(guò)夜,緊急情況也可以37℃孵育2小時(shí)。
3)倒掉抗原,每孔加入200ul的封閉液,4℃過(guò)夜或者37℃孵育2小時(shí)。
4)倒去封閉液,在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體,用洗滌液洗板三次,每次盡量拍干殘留液體,若要放置一段時(shí)間,盡量風(fēng)干板子,或30℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
5)取包好的96孔板,一孔加入陰性參照液50ul,第二孔加入陽(yáng)性參照液50ul,第三孔加入稀釋的抗體(1:500=抗體:封閉稀釋液),后面的第四孔到第12孔加入50ul的封閉稀釋液,然后取50ul稀釋的抗體進(jìn)行梯度稀釋,第12孔取出50ul的液體,保證每孔液體為50ul。再于37℃孵育1 小時(shí)。
6)倒掉液體,用洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100ul的HRP標(biāo)記的2抗(1:2000),于37℃孵育45分鐘。
7)倒掉液體,有洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100ul的TMB底物(A+B等體積配置,現(xiàn)配現(xiàn)用)溫室孵育5—20分鐘(根據(jù)顏色的改變速度)。
8)每孔加入100ul的終止液(0.M草酸),在酶標(biāo)儀上讀取450nm的吸光度。

抗體的純化。(一般用親和純化,這種方法得到的抗體的純度高一些。)
(1) 親和柱的制備
1)稱取0.3mg溴化QING活化的瓊脂糖凝膠加入1mmol/L的鹽酸中,4`C過(guò)夜使其充分溶漲,可獲得1ml溶漲膠。
2)將凝膠轉(zhuǎn)移入純化柱中,用約30ml 1mmol/L的鹽酸洗介質(zhì)3次。
3)用偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次,因?yàn)榛罨鶊F(tuán)在偶聯(lián)緩沖液PH值下易水解,所以此步驟zui hao在幾分鐘內(nèi)完成。
4)將溶解在5ml偶聯(lián)緩沖液中的10-60nmol的配體加入凝膠中,如需測(cè)定結(jié)合效率一定要取少量陪體溶液待測(cè)。
5)溫室下輕輕混合搖動(dòng)2小時(shí),或4`C過(guò)夜,如需測(cè)定結(jié)合效率此步驟結(jié)束后取少量溶液待測(cè)。
6)用30ml的偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次。
7)加入15ml阻斷緩沖液溫室孵育2小時(shí)或4`C過(guò)夜。
8)依次用20ml的偶聯(lián)緩沖液和20ml的乙酸鹽緩沖液洗介質(zhì)一次。重復(fù)4次步驟8。
9)重復(fù)4次步驟8。
10)配體固相化完成,可用于純化。
11)若不立即使用,用20%的乙醇封存。
(2)抗體的純化
1)原血清用PBS等體積稀釋,混勻1min,5000-10000r/min,4-20離心15分鐘,取上清,并留樣送檢。
2)用層析儀或手工,10倍體積的PBS 2-4ml/min流速清洗平衡柱子。
3)稀釋離心完的上清樣品,0.5-1ml/min流速上樣。
4)上樣完后,用15倍體積的PBS2-4ml/min流速清洗平衡柱子,洗去柱子上殘留的雜蛋白。
5)用5-10倍體積的Anitibody Elute Buffer C 洗脫結(jié)合在親和柱子上的抗體,分管收集,沒(méi)管收集1ml并預(yù)先滴加100ul Anitibody Elurte Buffer D調(diào)PH至中性(PH7-7.5),如果有層析儀也可以根據(jù)層析儀紫外吸收峰檢測(cè)收集。
6)洗脫完畢后,柱子用5倍體積的PBS 2-4mi/min流速清洗平衡。
7)用20%的酒精封存柱子,4`C保存。
(3)抗體的濃縮
1)一般收集濃度較高的幾管洗脫液,無(wú)須濃縮,若弄多實(shí)在太低(小于0.5mg/ml),則將收集的餾分加和起來(lái)。
2)轉(zhuǎn)移入15ml 的超濾管,3500r/min離心20分鐘左右(根據(jù)要濃縮的體積摸索離心時(shí)間),將濃縮好的抗體小心的用移液器取出來(lái)。
3)取700ul 濃縮的抗體檢測(cè)280nm的吸光度,讀數(shù)不要超過(guò)2,用吸光度讀數(shù)除以1.35,即為抗體的大致濃度。抗體的濃度也可以用(OD280nm-0.35xOD495nm)1.4這個(gè)公式計(jì)算。濃縮的程度:使抗體的濃度在0.5-1mg/ml之間zuihao。zuihou通過(guò)濃度x體積計(jì)算抗體的總量。
(4)抗體的保存
抗體中添加40-50%甘油,可以短時(shí)間存放于4℃,如需以后使用,一般500ul/管凍存于-20℃或者更低溫度的冰箱中。
(5)抗體純度的鑒定
 一般而言,我們?cè)趯⒖贵w純化以后,如果想知道抗體的純度和濃度究竟怎么樣,就需要走個(gè)SDS-PAGE電泳。電泳的方法在網(wǎng)上到處都是,在此就不多說(shuō)了。

原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司

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