細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也叫細(xì)胞克隆技術(shù),在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對(duì)于整個(gè)生物工程技術(shù),還是其中的生物克隆技術(shù)來說,細(xì)胞培養(yǎng)都是一個(gè)必不可少的過程,細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)模克隆。細(xì)胞培養(yǎng),既包括微生物細(xì)胞的培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞,這是克隆技術(shù)必不可少的環(huán)節(jié),而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。通過細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因?yàn)樯锂a(chǎn)品都是從細(xì)胞得來,所以可以說細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中zui核心、zui基礎(chǔ)的技術(shù)。
一、清洗
新采用和重新使用的培養(yǎng)器皿,都要嚴(yán)格清洗,以防各種有害物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞損害。培養(yǎng)用的塑料器皿目前主要依靠進(jìn)口,均已無菌密封包裝,可直接使用。對(duì)于塑料瓶蓋或膠塞等,可水中浸泡后用2%NaOH煮沸10~20min,自來水中浸泡和蒸餾水漂洗2~3次,晾干備用。細(xì)胞培養(yǎng)中的絕大部分器皿系玻璃制品,清洗過程為以下步驟。
1.浸泡 新使用或重復(fù)使用的玻璃器皿須經(jīng)5%鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min,水洗。以去除新購進(jìn)玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質(zhì),并消除其弱堿性。
2.刷洗 浸泡后用軟毛刷和的洗潔精進(jìn)行刷洗。
3.酸浸 刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當(dāng)晾干或烘干,以免造成酸浸液稀釋,影響效果。將玻璃制品完全浸泡入清潔液中24h。清潔液具有極強(qiáng)酸蝕作用,操作過程需戴防護(hù)用具。
4.沖洗 浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗,吸管需沖洗10min,器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復(fù)10次以上,不liu任何酸浸液殘跡,然后用蒸餾水漂洗2~3次,烘干備用。要求干凈透明,無油煙,不能殘liu任何有害物質(zhì)及化學(xué)藥品等。
二、消毒
1.包裝 器材經(jīng)清洗烤干或晾干后,先應(yīng)嚴(yán)格包裝,然后再行消毒滅菌處理,以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。
2.消毒 消毒滅菌隨物品的不同,而采用不同的方法。
(1)紫外線:主要用于消毒實(shí)驗(yàn)室空氣、工作臺(tái)面和一些不能使用其他方法消毒的培養(yǎng)器皿。進(jìn)無菌室前或做完實(shí)驗(yàn)后,均應(yīng)開燈照射30min進(jìn)行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細(xì)菌。
(2)消毒劑:操作者的皮膚、培養(yǎng)瓶的蓋和外壁常用點(diǎn)酒、酒精消毒。無菌室內(nèi)桌椅和物體的消毒可用0.1%新潔爾滅、過氧乙酸、來蘇兒等擦拭或浸泡。實(shí)驗(yàn)室、無菌室的消毒可用甲醛熏蒸(高錳酸鉀5~7.5g,加40%甲醛10~15ml,混合放入一開放容器內(nèi),立即可見白色甲醛煙霧,房間密閉24h即可)。
(3)干熱消毒:多用于玻璃器皿消毒,干熱烤箱180℃45~60min。
(4)濕熱消毒:培養(yǎng)液、橡膠制品、塑料器皿等用68kPa(115℃)高壓滅菌10min;布類、玻璃制品、金屬器械等用103kPa(121.3℃)高壓滅菌15~20min。
(5)濾過消毒:用孔徑200~450nm大小的濾板可除去培養(yǎng)液和試劑中的細(xì)菌和霉菌等。用200nm孔徑的濾板通過兩次,可使支原體達(dá)到某種程度的去除,但不能除去病毒。濾器分為負(fù)壓和加壓式兩種。過濾的液體量很少時(shí),可選用注射器微量濾膜濾器。
(6)60Co照射:不耐熱的塑料制品或一次性用品的滅菌可經(jīng)包裝后,用γ射線照射消毒。
三、無菌操作
無菌操作是防止污染、決定培養(yǎng)是否成功的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力,在一切操作中要努力做到zui大限度的無菌。工作前對(duì)手部需清洗消毒,進(jìn)無菌操作室時(shí)戴口罩和穿工作服。不能用手直接觸及已消毒器皿內(nèi)部。打開培養(yǎng)瓶前或封閉瓶口前須火焰燒灼瓶口等。
四、取材
取材應(yīng)注意無菌操作,防止污染。污染組織應(yīng)放入含兩性霉素B(2μg/ml)、青霉素(500u/ml)、鏈霉素(500μg/ml)的培養(yǎng)液中浸泡10~20min。取材后應(yīng)立即進(jìn)行培養(yǎng)。如因故不能培養(yǎng)時(shí),應(yīng)在無菌條件下,把組織塊切成1cm3大小置于培養(yǎng)液中37℃貯存。存放時(shí)間不宜超過24h。
1.源自人體的腫瘤和其他病理組織的取材、貯存和運(yùn)送須注意防止污染。
2.取血:多采用靜脈血,注意無菌操作,如需應(yīng)用肝素等抗凝劑,也要注意消毒處理。血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液,可采用離心法分離,500~1000r/min,離心5~10min即可。
3.動(dòng)物組織:動(dòng)物皮毛易隱藏微生物,且不易消毒,應(yīng)特別注意無菌操作。
五、細(xì)胞分散法
1.機(jī)械分散 對(duì)于腦、胚胎、腫瘤等軟組織,先用組織勻漿器研磨組織,再通過細(xì)胞篩獲得單細(xì)胞懸液。
2.胰蛋白酶消化 適合于消化間質(zhì)較少的軟組織,傳代細(xì)胞消化也常采用,是應(yīng)用較廣泛的消化酶,由于Ca2+ 和Mg2+ 對(duì)胰蛋白酶活性有一定抑制作用,因此須用不含這些離子的緩沖液配制。將組織剪成1mm3大小,置于容器中,加入30~50倍體積的0.25%胰蛋白酶液,消化30~60min。
3.膠原酶消化 對(duì)膠原有較強(qiáng)的消化作用,適用消化纖維組織、上皮組織及瘤組織等。膠原酶的使用終濃度為200U/ml或0.1~0.3μg/ml,其消化作用緩和。一般將3~5倍膠原酶溶液加入已剪碎的組織塊中,數(shù)小時(shí)或10余小時(shí)后,可見組織塊逐步變小至幾乎看不見,原來澄清的消化液轉(zhuǎn)變成混懸液時(shí),可以終止消化,如組織塊較大、細(xì)胞量較多時(shí),可于消化期間換消化液一次。消化液經(jīng)低速離心5min后,去上清液,加入20%小牛血清培養(yǎng)液,輕輕打散細(xì)胞團(tuán),制成細(xì)胞懸液。
4.EDTA溶液分散 使用濃度為0.02%的EDTA溶液。常用于傳代細(xì)胞的消化,作用溫和,毒性小。
六、淋巴細(xì)胞分離法
取肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀釋后,沿試管壁慢慢加入4ml淋巴細(xì)胞分離液之表面,勿與分離液混合。然后2000r/min水平離心20min,管內(nèi)分4層,自上而下依次為血漿、單個(gè)核細(xì)胞(位于細(xì)胞分離液上界與血漿下界的中間呈白色霧狀層)、顆粒白細(xì)胞(位于淋巴細(xì)胞分離液下界與底層紅細(xì)胞上界的交界處)和紅細(xì)胞(位于管底)。用毛細(xì)吸管沿管壁輕輕吸出的淋巴細(xì)胞層。然后用Hanks液洗兩次,每次2000r/min離心10min,zui后計(jì)數(shù)供用。
七、細(xì)胞計(jì)數(shù)
待測細(xì)胞懸液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%臺(tái)盼藍(lán)0.1ml(死細(xì)胞著色),混合后滴入血球計(jì)數(shù)板內(nèi)。于低倍鏡下計(jì)數(shù)4角的4個(gè)大方格內(nèi)的活細(xì)胞(透明未著色)總數(shù),然后用下式計(jì)數(shù):
細(xì)胞數(shù)/每毫升原液=(4大方格內(nèi)活細(xì)胞數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)
細(xì)胞存活率=(活細(xì)胞數(shù)/活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%
在計(jì)數(shù)時(shí)遇到對(duì)大方格壓線的細(xì)胞,應(yīng)按數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)。
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司