Western Blot實驗可以說是生物專業*基礎的實驗了,WB實驗出現*多問題的,應該就是各種背景問題了。為什么明明跑出了想要的趨勢,但就是背景臟?
這里要清楚一點，背景臟不一定是因為
儀器不干凈造成的,也有可能是蛋白降解或者整個實驗過程中條件不合適造成的,有可能是以下的環節出了問題:
1、 實驗準備
提取蛋白所需的研磨器材,以及制膠的玻璃板、梳子要清洗干凈。
若長期不使用,建議器材在實驗前再行清洗-次以杜絕相應的污染。
2.提取蛋白
選擇臺適的蛋白裂解液,充分去除一些干擾因素,比如核酸,多糖,脂類等。
建議蛋白在測量濃度后變性分裝保存，避兔反復凍融使蛋白發生降解。
3、制膠
灌膠之前要將配好的試劑充分混勻,灌膠的過程中要掌握好速度,緩慢加入,避兔產生氣泡。
灌注好分離膠后,緩緩加入無水Z醇封膠,該步操作時速度一定要慢 ,防止膠面被沖變形,在等待分離膠凝固的過程中,不要總去搖晃觀察。
溫度較高的情況下, 30min左右就會凝固,冬天氣溫較低可能需要較長時間。
若分離膠液面不平,會影響后期蛋白電泳的效果。
4.轉膜
轉膜前需在轉膜板兩側各放置3-4張濾紙(兩側數量相同) 。
切記不要用手直接接觸PVDF膜和濾紙,手上的油脂會對其造成污染,務必佩戴干凈的手套,全程盡量使用鑷子夾取。
轉膜過程中海綿濾紙凝膠-PVDF膜濾紙海綿每-層的氣泡要排空。
轉膜時要使整個電轉儀置于冰水混臺物中,常用220V或者其他高電壓進行。
機器溫度升高,會使蛋白降解,也就是轉膜后,用麗春紅染色發現條帶跑糊,發光后條帶和背景也會臟的一塌糊涂。
5.孵育抗體
孵育一抗的時間大多會選擇4°C過夜,也可以室溫封閉2小時, 4°C過夜效果會比室溫好, 4°C過夜具體多長時間算合適,其實沒有硬性規定。二抗孵育的時間不宜過長, -般是室溫下搖床孵育1~2小時,抗體孵育完成后要清洗干凈,特別是二抗孵育完成后 ,否則可能導致顯影結果出現高背景。
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