1.脫鹽
寡核苷酸合成后,為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結構,首先必須去除保護基團。通過濃氨水處理,合成的寡核苷酸從固相載體上分離,2-氰乙氧基--磷酸二脂鍵的保護基團,以及堿基的保護基團基(苯甲酰基和異丁基)被去除,從而形成了天然的DNA結構。然而,必要的去保護步驟完成后,寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機化合物。所有非必須有機化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機雜質,但它不能有效移除合成中產生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而,脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足PCR檢測等基礎生物研究。
2.BioRP / OPC純化
如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成,則N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基團,提前終止的寡核苷酸不包含該基團。因為DMT基有強的親脂的特性,有5’-DMT基團的寡核苷酸與反相樹脂有親和性,因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和5’-DMT寡核苷酸存在強親和力,但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團,所以,我們能夠成功的把想要的N-甲基寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質中分離出來。
3.HPLC
如果合成的寡核苷酸應用于克隆,定向誘變或定量的基因探測,那么對其純度要求較高。脫鹽或OPC純化的寡核苷酸可能達不到要求,則HPLC純化被廣泛地用于這個目的。作為一種純化樹脂,陰離子交換樹脂或反向樹脂被用于寡核苷酸純化。陰離子交換樹脂的HPLC通常顯示95-98%純化效率,對于達到35-mer寡核苷酸的純化是充分的。反向樹脂化的HPLC與陰離子交換樹脂的HPLC呈現相似的純化效率。因為HPLC的純化效率很大程度依靠寡核苷酸的長度,用HPLC法不能有效純化長的寡核苷酸(大于35-mer)。
4.PAGE
對于長的寡核苷酸的純化(50-100mer),我們推薦PAGE純化法,它使用交連的聚丙烯酰胺凝膠(電泳)作為純化基質。盡管PAGE顯示出高的純化效率(>98%),但它在額外的步驟方面有一些缺陷,比如在PAGE之后需要提取和脫鹽,繼而將導致純化產率的下降。
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