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正確配制MTT試劑的方法,你知道嗎?

點(diǎn)擊次數(shù):14925   發(fā)布時(shí)間:2020/9/9 9:58:23

一、MTT試劑主要有兩個(gè)用途:

1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對(duì)體外培育的細(xì)胞毒性的測(cè)定;

2.細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。

二、MTT試劑原理:

檢查原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT試劑還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中,而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲臜,用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值(OD值),來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量,OD值越大,細(xì)胞活性越強(qiáng)(如果是測(cè)藥物毒性,則表示藥物毒性越小)。

三、配制方法——懸浮細(xì)胞

1.收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml,按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640(無(wú)血清)培育基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培育液稀釋 (儲(chǔ)存液100mg/ml,需預(yù)試尋找zui佳稀釋度,1:10-1:20);③需檢查物10ul;④細(xì)胞懸液50ul(即5×104cell/孔),共100ul參入到96孔板(邊緣孔用無(wú)菌水填充)。每板設(shè)對(duì)照(加100ml 1640)。

2.置37℃,5%CO2孵育16-48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察。

3.每孔參入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),繼續(xù)培育4 h。(懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1,培育4 h后可跳過(guò)步驟4,直接酶聯(lián)免疫檢查儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))測(cè)量各孔的吸光值)

4.離心(1000轉(zhuǎn)x10min),小心吸掉上清,每孔參入100 ul二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢查儀OD570nm(630nm校準(zhǔn))測(cè)量各孔的吸光值。

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