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酶聯免疫ELISA試劑盒吸附法的起源及原理

閱讀次數：1342 發布時間：2015/1/8 9:26:46

酶聯免疫吸附法（ELISA）　　原理：ELISA可用于測定抗體，也可用于檢測杭原。其基本原理是采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。3種必要的試劑： ①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）； ②酶標記的抗原或抗體（標記物）； ③酶作用的底物（顯色劑）。　　ELISA過程包括：抗原吸附在固相載體上，這個過程稱為包被，加待測抗體, 再加相應酶標記抗體，生成抗原－－待測抗體－－酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。借助分光光度計的光吸收計算抗體的量。　　根據檢測目的和操作步驟不同，有以下三種類型的常用方法： 3.1間接法此法是測定抗體*常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體。加人待檢標本（含相應抗體）與之結合。洗滌后，加人酶標抗球蛋白抗體（酶標抗抗體）和底物進行測定。 3.2雙抗體夾心法此法常用于測定抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加人待檢標本（含相應抗原）與之結合。溫育后洗滌，加人酶標板中。 3.3競爭法此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體。加入待測抗原和一定量的酶標已知抗原，使二者竟爭與固相抗體結合；經過洗滌分離，*后結合于固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關。一、酶聯免疫吸附法測定抗體含量（競爭法） 1、儀器設備酶聯免疫檢測儀（Bio－550）；酶標板（96孔）；微量注射器。 2、試劑（1）HRP標記羊抗兔Ig G（1:1 000，國產）；標準牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；（2）包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,蒸餾水稀釋至100 mL。（3）稀釋液與洗滌液：0.01mol/LpH7.4 PBS－－Tween－－20, ４℃，保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20，0.5mＬ。蒸餾水加至1000mＬ。（4）封閉液：含0.1%明膠0.01mol/L PBS， pH7.4。（5）鄰苯二胺底物溶液（臨用前配制）：臨用前將Na2HPO4·12H2O 2.9g,檸檬酸0.51g溶于100mL蒸餾水中, 再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。（6）終止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸餾水中加入98%濃硫酸76mL混均即可。 3、操作方法（1）將抗原結合在酶標板上。取標準IgG（10mg/mL）用碳酸鹽緩沖溶液稀釋，得到濃度為0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加標準抗原的兩孔為對照，為反應的0%值，將反應板于4℃放置一夜（8個樣品，分3個平行，4個100%值孔；共28+2孔）。（2）標準牛IgG與初級抗體一兔抗牛血清的反應。將標準IgG（10mg/mL）用稀釋液作二倍稀釋得到一系列不同濃度的標準牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀釋好的200μL的兔抗牛血清中，其中4個不加標準牛IgG作為測量時的100%值。4℃反應放置一夜。（3）封閉板。將包被好的酶標板孔內液體傾去，進行洗滌，各孔加200μL洗滌液后室溫下放置1min，倒掉，如此重復4次后，在吸水紙上拍干，加封閉液進行封閉，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封閉液）。封閉后，如前述洗滌。（4）向酶標板中加人標準抗原和抗體的混合物。將標準牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶標板孔內，同是4個未加抗原的100%值的平行樣也加入酶標板中。37℃放置2h，再洗板4次。（5）加人HRP標記的羊抗兔Ig G。洗滌后每孔加100μL稀釋好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗滌。（6）加人OPD底物。洗板4次后，每孔加人100μL底物溶液，于37℃暗處反應20min后，每孔加人50μL結束反應液以終止反應。（7）吸收測定。用酶聯免疫檢測儀測定波長為492nm下的吸光值。（8）數據處理。標準曲線是以Ig（標準牛IgG含量）對B/Bo作圖，求得線性方程。其中，C為標準牛IgG含量；B為不同濃度標準牛IgG吸收值與0%吸收值之差;Bo為100吸收值與0%吸收值之差。