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閱讀次數:1760 發布時間:2012/8/29 9:19:40
一、原理 :
在濃氯化鈉(1―2mol/L)溶液中,脫氧核糖核蛋白的溶解度很大,核糖核蛋白的溶解度很小,在稀氯化鈉(0.14 mol/L)溶液中,脫氧核糖核蛋白的溶解度很小,核糖核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同濃度的氯化鈉溶液,將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。
將抽提得的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸鈉)處理,DNA或(RNA)即與蛋白質分開,可用氯仿―異戊醇將蛋白質沉淀除去,而DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量乙醇,DNA即析出。
為了防止DNA或(RNA)酶解,提取時加入EDTA(乙二胺四乙酸)
二、實驗材料與儀器 :
1、小白鼠肝臟
2、勻漿器
3、離心機5000r/min
4、量筒50ml(×1),25 ml(×1),10 ml(×1)
5、 吸管5 ml(×2)
6、水浴鍋
7、真空干燥器
三、試劑 :
1.5 mol/L NaCl 溶液:將292.3g NaCl 溶于水,稀釋至1000ml。
2.0.14mol/L NaCl―0.15mol/L EDTA―Na 溶液: 溶8.18g NaCL 及37.2g EDTA―Na 于蒸餾水,稀釋至1000ml。
3.25% SDS 溶液: 溶25g 十二烷基硫酸鈉于100ml 45% 乙醇
4.0.015 mol/L NaCL―0.0015 mol/L 檸檬酸三鈉溶液: 氯化鈉 0.828 g 及檸檬酸三鈉0.341g 溶于蒸餾水,稀釋至1000ml。
5.氯仿―異戊醇混合液:氯仿:異戊醇=24:1(V/V)。
6.1.5 mol/L NaCL―0.15 mol/L檸檬酸三鈉溶液:氯化鈉 82.8 g 及檸檬酸三鈉34.1 g溶于蒸餾水,稀釋至1000ml。
7.3 mol/L乙醇鈉―0.001 mol/L EDTA―Na溶液: 稱取乙酸鈉 408 g,EDTA―Na 0.372g 溶于蒸餾水,稀釋至1000ml。
8.70%乙醇,80%乙醇,95%乙醇,無水乙醇。
9.二苯胺試劑
10.1 mol/L過氯酸溶液:將10ml過氯酸(70%)用蒸餾水稀釋至110ml。
四、操作 :
1. DNA的分離純化:
(1)將10頭小白鼠迅速殺死,取出肝臟,用0.14mol/LNaCl―0.15mol/l EDTA溶液洗去血漿,剪碎,加入50ml 0.14mol/L NaCl―0.15mol/l EDTA溶液,置勻漿器中研磨,待磨成糊狀后,將糊狀物離心10分鐘(4000r/min),棄去上清液,沉淀用0.14mol/L NaCl―0.15mol/L EDTA溶液洗二、三次,所得沉淀為脫氧核糖核蛋白粗制品。
(2)向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCl―0.15mol/L EDTA溶液,使總體積為44ml,然后滴加25% SDS溶液 3ml,邊加邊攪拌,加畢,置60水浴保溫10分鐘(不停攪拌)溶液變的粘稠并略透明,取出冷至室溫。此步操作是使核酸與蛋白質分離。
(3)加入5mol/LNaCL10ml,使NaCl *終濃度達到1mol/L,攪拌10分鐘,加入月約一倍體積的氯仿―異戊醇混合溶液,振搖20分鐘,離心10分鐘(4000r/min)。去掉沉淀,上層清液徐徐加入1.5―2倍95%乙醇,DNA沉淀即析出,用玻棒慢慢攪動,則DNA絲狀物即纏在玻棒上。
(4)將DNA粗品置于27ml 0.015 mol/L NaCl ―0.0015 mol/L檸檬酸三鈉溶液中,再加入3ml 1.5 mol/L NaCl―0.15 mol/L檸檬酸三鈉溶液,攪勻,加入一倍體積氯仿―異戊醇混合液,振搖十分鐘,離心(4000r/min,10分鐘),傾出上層液體(沉淀棄去),加入1.5倍體積95%乙醇,DNA即沉淀析出。離心,棄去上清液,沉淀(粗DNA)按本操作步驟重復處理一次。
(5)將上步所得沉淀于27ml 0.015 mol/L NaCl―0.0015 mol/L檸檬酸三鈉溶液中,然后以線狀徐徐加入2倍95%乙醇,邊加邊攪,取出絲狀DNA,依次用70%,80%,95%以及無水乙醇各洗一次,真空干燥。
2. 鑒定: 用二苯胺法測定DNA。
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