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閱讀次數:1447 發(fā)布時間:2012/9/4 10:37:44
干轉移
trans-bot處裝配
1。準備轉移緩沖液。
2。電泳后的凝膠,平衡轉移緩沖液。平衡有利于消除電泳緩沖鹽和洗滌劑。所需的時間平衡是依賴于凝膠厚度。例如,15分鐘為0.75毫米,SDS - PAGE凝膠。
3。切膜的層面的凝膠。濕膜慢慢滑動它在45°角度轉移到緩沖區(qū),讓它浸泡15 - 30分鐘。
4。切濾波器紙張尺寸的凝膠。兩根粗過濾紙(或六片薄濾)凝膠需要為每個膠/膜三明治。完全飽和濾紙浸泡在轉移緩沖液。
5。如果有一個以上的全尺寸的凝膠是在同一時間內傳輸,剪下一塊透析膜與適當的分子量截止到層面的凝膠。完全濕透析膜轉移緩沖液。
單位組裝標準轉移
(戴上手套,這一程序,以避免污染的膜。)
1。拆下安全蓋和不銹鋼陰極組件。
2。將預浸片過濾紙上的鉑陽極。滾管或試管在濾紙表面(如搟面杖)排除所有的空氣氣泡。如果薄過濾紙使用,重復2張buffer-soaked過濾紙。
3。把濕印跡媒體頂部的過濾紙。推出所有氣泡。
4。小心地將平衡凝膠上的轉印膜,將凝膠膜的中心。轉移是不完整的,如果任何一部分的凝膠印跡介質外。推出所有氣泡。
5。把另一片預浸泡濾紙頂部的凝膠,仔細去除氣泡之間的凝膠和過濾紙。如果細過濾紙使用,三片上方的凝膠,消除泡沫從每一層之間。
6。如果有一個以上的全尺寸的凝膠被轉移,地方片預浸透析膜過濾器頂部的紙堆。重復步驟2。多達四個迷你凝膠可以轉移的同時,把它們并排在陽極平臺。
7。小心地將陰極到堆棧。出版社從事鎖存器與導柱無干擾的過濾紙堆。
8。地方上的安全蓋裝置。插頭插進電源。極性是正常轉移到陽極陰極,即,紅的紅和黑的黑風口的電源供應器。
注意:不要反向極性。這將導致損壞的不銹鋼陰極。
9。打開電源。轉移迷你凝膠15 - 30分鐘。在10月15日五大凝膠可以轉移的30分鐘到1個小時。在15 - 25訴不超過25伏與儀器。一個電流限制(3毫安/厘米~ 2大型凝膠;5.5毫安/厘米迷你凝膠)的建議,防止過度加熱運行期間。在強大的領域發(fā)展這種裝置,轉移可能并不總是定量。一定量的蛋白質可能被轉移通過膜上下過濾紙。(即恒流~ 15線2迷你凝膠)
10。下列轉移,使電源關閉,并斷開單元從電源供應器。刪除安全罩和陰極組件。拋棄過濾紙(和透析膜,如果使用)。傳輸效率可以監(jiān)測染色的凝膠與考馬斯亮藍R -蛋白質染色或酶標儀的銀染試劑盒。另外,預分子量標準可以使用,或部分的膜可以染色,總蛋白膠體金,生物印跡總蛋白染色,或陰離子染料如氨基黑。zeta-probe膜可以染色的biotin-blot總蛋白染色。
十二烷基硫酸鈉可能被添加到緩沖區(qū)1增加蛋白洗脫從凝膠:
48三甘氨酸,39毫米,1.3毫米(20%甲醇),十二烷基硫酸鈉(0.0375%),9.2。
溶解5.82克和2.93克甘氨酸三,十二烷基硫酸鈉和0.0375克或3.75毫升的10%十二烷基硫酸鈉在ddh2o(加入200毫升甲醇);調整體積為1升的稀ddh2o。
不添加酸或堿調整pH值。
托賓轉移緩沖sds-proteins使用硝酸纖維素(甲醇)或zeta-probe膜(無甲醇):
在25毫米,192毫米甘氨酸(20%甲醇),PH值8.3
溶解3.03克和14.4克甘氨酸三ddh2o(加入200毫升甲醇);調整容積為1升的ddh2o。
不添加酸或堿調整pH值
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