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閱讀次數:1346 發布時間:2012/9/5 9:14:11
磷酸鈣轉染法
材料:
質粒DNA
指數生長的真核細胞
2 M CaCl2
2×HBS (pH 7.05)
配方:
2×HBS (pH7.05):900 ml 超純水中加入NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214
g,Glucose 2.4 g 和HEPES 10 g,調pH 至7.05,定容至1 升,過濾(0.2 μm 濾
膜)后儲存于4℃備用。
方法:
1. 細胞分盤: 通過胰酶消化收集細胞,用適當的完全培養基以1×105 至4×105
細胞/cm2 的密度平鋪細胞于60 mm 組織培養皿上(根據實驗需要選擇培養皿,
使細胞貼壁后所占面積達到培養皿總面積的40-70%)。將細胞置于含5%
CO2 的37℃溫箱中孵育8-24 h,當細胞貼壁完全后即可開始轉染。轉染前2 h 換
液(用4 ml 新鮮的完全培養基置換舊的培養基)。
注:為得到較高的轉染效率,盡量使用指數生長的細胞,轉染時細胞的密度不
超過80%。
2. 制備磷酸鈣-DNA 沉淀:以60 mm 組織培養皿用500 μl 反應總體積為例。在
滅菌水中加入質粒DNA(總量4-10 μg 為佳),再加入31 μl 2 M CaCl2,使三
者總體積達到250 μl,混勻。將等體積2×HBS 鹽溶液逐滴加入,同時輕彈管
壁,使每滴加入后及時混勻。靜置2 min 后,立即將這500 μl 的磷酸鈣-DNA
懸液逐滴加入上述單層細胞的細胞培養基中,輕輕搖動平皿混勻。
注:可以觀察到滴入的部位培養基瞬間會出現渾濁的橘黃色,應盡快將其混勻,
避免形成過大的顆粒,影響轉染效率。
3.若轉染的細胞不用轉染促進劑處理,則置于含5% CO2 的37℃溫箱孵育。8 h
后吸去培養基與DNA 沉淀,加入5 ml 37℃預熱的完全培養基,繼續將細胞放
置溫箱孵育,16-40 h 觀察其轉染效率。
參考:分子克隆實驗指南第三版(p1284~1285)
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