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閱讀次數:1603 發布時間:2012/9/7 10:00:16
一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時,細胞內和外環境中的水都會形成冰晶,能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、
PH改變、蛋白變性等,能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑,可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下,能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯
存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時速度要快,使之迅速通過細胞*易受損的-5~0℃,細胞仍能生長,活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對細胞無毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細胞。
二、操作步驟
(一)凍存
1、消化細胞(同實驗二),將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養,計數,調整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中,每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口,封口一定要嚴,否則復蘇時易出現爆裂。
6、貼上標簽,寫明細胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘〕→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態氮(30分鐘)→液氮。
注意:操作時應小心,以免液氮凍傷。液氮定期檢查,隨時補充,絕對不能揮發干凈,一般30立升的液氮能用1~1.5月。
(二)復蘇
1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞,內裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。
3、打開凍存管,將細胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鐘,棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養液,吹打均勻,再離心10分鐘,棄上清液。
6、加適當培養基后將細胞轉移至培養瓶中,37℃培養,第二天觀察生長情況。
三、試劑和器材
器材:液氮罐、凍存管(塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機等
試劑:0.25%胰酶、培養基、含保護劑的培養基(即凍存液)
附:凍存液配制:
培養基加入甘油或DSMO,使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。
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