gel-elongation分析二型脂肪酸合成

型脂肪酸合成（fasii）是必不可少的細(xì)菌細(xì)胞活力。顯著性差異的細(xì)菌和人類在組織結(jié)構(gòu)，酶，和所發(fā)揮的作用脂肪酸使這一途徑的一個(gè)有吸引力的目標(biāo)抗菌藥物發(fā)現(xiàn)（參。2）。兩年銷售抗菌藥物這一目標(biāo)的費(fèi)邊酶是三氯生（防腐劑）和異煙肼（一種抗結(jié)核劑）（參3 , 4）。天然產(chǎn)品，淺藍(lán)菌素（參考文獻(xiàn)5）和thiolactomycin（參考文獻(xiàn)6）選擇性抑制縮合酶fabh和fabf /乙，二十多年前被發(fā)現(xiàn)。新的篩選努力與現(xiàn)有的化學(xué)修飾化合物已試圖找出更多的選擇和有效的抑制劑。確定選擇性抑制劑確定在篩選的努力，我們開發(fā)gel-elongation試驗(yàn)使用原油細(xì)菌裂解液直接確定具體目標(biāo)的脂肪酸合成酶抑制劑（參。7 , 8）。

材料

試劑

數(shù)碼地面電視從費(fèi)雪（bp172-5）；β-巰基乙醇是從儀（161-0710）。[ 2-14c ]丙二酰輔酶A（60毫居里/濃度，珀金埃爾默，nec612），非加太（西格瑪，a7303）預(yù)處理3毫米數(shù)碼地面電視的冰上20分鐘，等分和儲(chǔ)存在- 80攝氏°淺藍(lán)菌素和thiolactomycin購自西格瑪。三氯生可以從塑料，003384。尿素，PVD F膜，10三/甘氨酸緩沖液和本地蛋白樣品緩沖購自美國伯樂。

設(shè)備

凝膠電泳儀，熒光屏和phosphorimager掃描儀

時(shí)間

2天。一天一個(gè)運(yùn)行fasii法，解決它的凝膠和夜間轉(zhuǎn)移到PVD F膜蛋白。第二天揭露phosphorscreen蛋白綁定到聚偏氟乙烯膜和掃描圖像使用phosphorimager掃描儀

程序

1）fasii gel-elongation法是由preincubating 0.25 - 2µ克大腸桿菌或金黃色葡萄球菌裂解液與串行稀釋抑制劑在室溫下20分鐘在50µ我的緩沖區(qū)含有100毫米磷酸鈉（7），5毫米，1毫米，1毫米的核苷酸，核苷酸，150µ米數(shù)碼地面電視，5毫米ß-巰基乙醇，20µ米乙酰輔酶A或n-octanoyl-coa或任何其他�；�輔酶A需要，4%二甲基亞砜，8µ米非加太預(yù)處理技術(shù)。

2）的反應(yīng)是由另外的10µ升的水稀釋[碳14 ]丙二酰輔酶A，使終濃度為4µ米丙二酰輔酶A。

3）反應(yīng)是培養(yǎng)在37攝氏°30分鐘，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的裂解液60分鐘。

4）反應(yīng)后，10µ我（加10倍µ我原樣品緩沖）每個(gè)樣品直接應(yīng)用到16 %聚丙烯酰胺凝膠含有一系列0.4米至4米尿素需要。

5）凝膠的解決和轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（聚偏二氟乙烯）膜，暴露在熒光屏和可視化利用phosphorimager掃描儀。

故障排除

關(guān)鍵步驟

尿素濃度是至關(guān)重要的分離acyl-acps鏈長度。活動(dòng)的裂解液中不同的細(xì)菌菌株。因此，需要fasii活性試劑需要優(yōu)化滴定。乙酰輔酶A不是一個(gè)理想的基板為金黃色葡萄球菌（參考文獻(xiàn)9）。

預(yù)期的結(jié)果

在細(xì)菌中，fabh催化首先縮合反應(yīng)使用乙酰輔酶A和malonyl-acp產(chǎn)生acetoacetyl-acp。本產(chǎn)品是減少了導(dǎo)彈快艇，脫水的蠶豆/生產(chǎn)c4:1（Δ2）-非加太國家，進(jìn)而減少了二次費(fèi)邊使butyryl-acp（c4:0-acp）是基fabf /冷凝酶。淺藍(lán)菌素，選擇性fabf /乙抑制劑，在200µ克/毫升積累butyryl-acp和thiolactomycin（333µ克/毫升）抑制fabh和fabf /冷凝酶造成輕微的積累butyryl-acp離開一個(gè)廣大malonyl-acp未。三氯生（100µ克/毫升）治療導(dǎo)致的積累c4:1（Δ2）-非加太國家由于其抑制法幣。在凝膠延長分析利用大腸桿菌提取物（圖1），觀察抑制與平板霉素（167µ克/毫升）是類似于看到淺藍(lán)菌素，和不同的觀察與thiolactomycin和三氯生，表明平板霉素選擇目標(biāo)fabf / B .同樣，滴定平板霉素的使用金黃色葡萄球菌的凝膠延長分析，與octanoyl-coa（c8:0）和丙二酰輔酶A作為基板，顯示一個(gè)集成電路~ 50 ~ 0.2µ克/毫升（圖2）。在較高濃度的平板霉素的積累malonyl-acp觀察，表明這種抑制劑不fabd一塊，丙二酰輔酶A：非加太轉(zhuǎn)酰基酶。低濃度的平板霉素生產(chǎn)部分抑制伸長活動(dòng)和積累c2n：0-acp

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