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公司新聞

半定量RTP CR

閱讀次數:1692   發布時間:2012/9/14 8:56:15

RT - PCR不僅可以用來檢測特定基因semi-quantitate水平因此一個可以比較轉錄水平在不同的樣品這可以通過不同的方式一是定量轉錄水平從控制看家基因如肌動蛋白(轉錄的看家基因被認為是了幾乎所有的實驗條件。另一種方法是添加一個引物特異性聚合酶鏈反應在反應外源性模板

量化看家基因轉錄

該方法包括逆轉錄使用寡核苷酸引物隨機引物由此產生的基因從而代表兩個看家基因轉錄以及具體的成績單量化逆轉錄反應然后放大在一個對聚合酶鏈反應系列-系列放大看家基因(用磷酸甘油醛脫氫酶等等特異性引物和其他的特定基因的興趣(在不同的基因利用基因特異性引物)

不同的聚合酶鏈反應管內的每一個系列的建立等,他們在不同的數額模板(金額逆轉錄反應產物[基因]或進行聚合酶鏈反應擴增循環數不同這是因為,聚合酶鏈反應擴增雖然理論上對數不太高或低數量擴增周期對數指數擴增通常只發生在中東的周期,這取決于濃度目標模板比較因此可以在這一階段

聚合酶鏈反應后,同體積的反應產物的電泳瓊脂糖凝膠上(是在同一凝膠圖像的彩色脫氧核糖核酸產物然后獲得和分析的視覺比較或與計算機軟件(如圖像論文一個例子是如下,半定量的目視檢查表達fut9基因在細胞系lec12lec29

可以看出,1)兩個細胞系指數擴增fut9發生在周期33 - 422)帶強度在這些周期表明幾乎相同水平的模板(基因)是用于什么細胞系3)fut9水平約6 - 9周期'behind ' ' lec12lec29

注釋

1。應該做一個試點實驗,首先是要確保只有單一的具體的產品獲得的引物得到一個想法的一系列周期或逆轉錄反應稀釋使用

2。一開始應該與等量的核糖核酸聚合酶反應

3。所有的反應進行的同時使用試劑,準備作為一個supermix減少任何變化

4。產物應該是運行在同一凝膠減少任何變化

5。定量比較罕見的成績單它可以更好地用于控制那些看家基因的轉錄在一個較低的水平例如醛縮酶表示在一個較低的水平相比,基因

6。當進行聚合酶鏈反應不同周期數,建立聚合酶鏈反應的反應消除他們一點零一分在中東的擴展階段期間所需的聚合酶鏈反應循環然后在水浴在65~75幾分鐘保證延伸完成

7。反應不同反應(通常是一個系列的2或3倍稀釋逆轉錄反應使用逆轉錄反應沒有模板的不同反應的反應相同數量的反應但不同數量的基因)這是必要的,因為成分比其他基因的逆轉錄反應(如逆轉錄數碼地面電視等)可以影響反應效率

半定量使用外源性標準

一個可以有外源性標準(無論是核糖核酸或核酸可以被放大使用相同的引物,擴增轉錄的興趣標準的目的是相同的序列轉錄興趣除了是40 - 50個核苷酸短或更長不同數量的標準是用來在不同的聚合酶鏈反應的反應(如標準是一種核糖核酸是前加入逆轉錄步驟)和擴增相同數量的周期外源性標準競爭與內源性模板因此,這個策略也被稱為競爭性RTP CR

產品electophoresed和定量的軟件和一個標準'amount '與'強度' ' 'band繪制

在這個例子中所示,產品1是從標準和2是由內源性轉錄可以看出,數額標準加入反應為5道大致等于轉錄

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