蛋白質與多肽激素的放射免疫分析

節　概述

　　1960年，美國學者Yalow 和Berson 創立了放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），并首先用于糖尿病人血漿中胰島素含量的測定。這是醫學和生物學領域中方法學的一項重大突破，開辟了醫學檢測史上的一個新紀元。它使得那些原先認為是無法測定的極微量而又具有重要生物學意義的物質得以精確定量，從而為進一步揭開生命奧秘打開了一條新的道路，使人們有可能在分子水平上重新認識某些生命現象的生化生理基礎。其后30年中，內分泌科學的飛速進展，充分證明了這一超微量分析技術的巨大推動力。1977年，這項技術的發明者榮獲諾貝爾生物醫學獎。隨后這一嶄新的技術迅速滲透到醫學科學的其它領域，如病毒學、藥理學、血液學、免疫學、法醫學、腫瘤學等，以及與醫學生物學相關的學科，如農業科學、生態學及環境科學等。放射免疫分析的物質，由激素擴大到幾乎一切生物活性物質。我們放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速發展與普及，對我國生物醫學的進展起著很大的促進作用。

　　一、放射免疫分析的優缺點

　　（一）RIA的優點

　　放射免疫分析具有許多其它分析方法無可比擬的優點。它既具有免疫反應的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度，因此能精確測定各種具有免疫活性的極微量的物質。

　　1．靈敏度高一般化學分析法的檢出極限為10^-3～10^-6g,而RIA通常為10^-9（毫微克，ng）、10^-12g（微微克,pg），甚至10^-15g（毫微微克，fg）、10^-18g（微微微克，ag）。

　　2．特異性強由于抗原—抗體免疫反應專一性強，所被測物一定是相應的抗原。良好的特異性抗體，能識別化學結構上非常相似的物質，甚至能識別立體異構體。

　　3．應用范圍廣據不完全統計，目前至少已有300多種生物活性物質已建立了RIA。它幾乎能應用于所有激素的分析（包括多肽類和固醇類激素），還能用于各種蛋白質、腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原、寄生蟲抗原以及一些小分子物質（如環型核苷酸等）和藥物（如地高辛、毛地黃甙等）的分析，應用范圍還在不斷擴展。近年來由于小分子半抗原制備抗體的技術有很大的發展，有人預測幾乎所有的生物活性物質，只要其含量不低于RIA的探測極限，都可建立適當的RIA法。

　　4．操作簡便RIA所需試劑品種不多，可制成配套試劑盒；加樣程序簡單一次能分析大量標本，標本用量也少；反應時間不長；測量和數據處理易于實現自動化；RIA屬體外分析技術，對患者無任何輻射危害。

　　（二）RIA的缺點

　　1．只能以免疫反應測得具有免疫活性的物質，對具有生物活性百失去免疫活性的物質是測不出的。因此RIA結果與生物測定結果可能不一致。

　　2．由于使用了生物試劑，其穩定性受多種因素影響，需要有一整套質量控制措施來確保結果的可靠性。

　　3．靈敏度受方法本身工作原理的限制，對體內某些含量特別低的物質尚不能測定。

　　4．由于放射免疫分析是競爭性的反應，被測物和標準物都不能全部參與反應，測得的值是相對量而非絕對量。

　　5．存在放射線輻射和污染等問題。

　　盡管RIA存在以上缺點，但它畢竟是定量分析方法的技術。隨著科學技術的進步，放射免疫分析技術將會得到更加廣泛、更加深入的發展。

　　二、基本原理

　　放射免疫分析技術，是把放射性同位素測定與抗原、抗體間的免疫化學反應兩種方法巧妙地結合起來所形成的一種超微量物質的測定方法。

　　RIA的基本原理，是利用標記抗原（*Ag）和非標記抗原（Ag）對特異性抗體（Ab）發生競爭性結合。競爭結合反應可用下式表示：

　　在上述反應系統中，當只有*Ag和Ab時，只產生*Ag—Ab復合物，并保持可逆的動態平衡。如反應系統中同時加入Ag,因Ag 與*Ag 免疫活性完全相同，故與Ab具有相同的親合力。當*Ag為一定量、Ab為有限量、Ag 與* Ag 的量之和超過Ab上的有效結合位點時，*Ag –Ab復合物的生成量與Ag 的量之間呈一定的函數關系。即當Ag 量少時，Ag –Ab生成量多，而*Ag –Ab生成量增多，游離的*Ag 減少。可見*Ag –Ab復合物生成量是受Ag含量制約的。因此，在放射免疫分析中，用已知不同濃度的標準物和一定量的*Ag及限量的Ab反應，采取一定方法將B與F分開，即可算出該標準物在各濃度下*Ag –Ab復合物的結合百分率（B/T）。

　　這一反應過程，可用以下簡圖（圖8-1）說明。圖中黑圈表示標記抗原，白圈表示非標記抗原，長條代表抗體，每個抗體有兩個結合位點，標記抗原與非標記抗原對抗體有同等的結合能力。

圖8-1 放射免疫分析原理示意圖

　　從圖中可見，當標記抗原與抗體量一定時，結合率（B/B+F）隨抗原量增加而降低。在實際工作中，以B/T的值為縱座標，標準物的濃度為橫座標，繪成曲線，即競爭性抑制曲線，或稱準確曲線。將未知濃度的樣品按同樣條件操作，所得結合率（%）與標準曲線相比，即可查出樣品中待測抗原的濃度。

　　放射免疫分析典型的操作程序如下：首先配制一系列已知濃度的標準溶液，并各取一定體積；于其中加入一定量的標記抗原和特異性抗體；在一定條件下使之反應平衡后，采取適當方法將B與F分離；分別測量其放射性；繪制標準曲線（圖8-2）。對樣品中抗原的測定，則可在同樣條件下操作，在標準曲線上查得含量。

圖8-2 標準曲線左：橫座標為等份刻度；　右：橫座標為對數刻度

　　由此可見，要成功地進行放射免疫分析，必須解決好以下3個關鍵性技術問題：

　　（1）標記抗原：要求其純度高、免疫化學活性好、比放射性強、用量適當。

　　（2）制備抗體：要求其特異性高、選用的稀釋度適當。

　　（3）分離B與F：理想的分離方法應當是分離完全、穩定可靠、操作簡單、適用范圍廣。

第二節　放射性碘標記

　　在RIA中，標記抗原質量的優劣，直接影響測定結果，必須制備比放射性強、純度高的標記抗原，并保持免疫活性不受喪失。

　　一、同位素的選擇

　　同位素有穩定性和放射性兩種。放射性同位素可利用其衰變時放出的放射線進行測量，這種測量較靈敏而方便，故多用放射性同位素。標記抗原，常用的放射性同位素有³H、¹⁴C、¹³¹I和¹²⁵I等。在使用上各有其優缺點，可根據所進行的放射免疫分析的類型特點，標記物制備和供應情況以及實驗室設備條件等作適當的選擇（表8-1）。大多數抗原分子中都含有C、H等原子，所以用¹⁴C或³H標記不改變抗原的結構及其免疫學活性，且¹⁴C、³H半衰期長，所標記的抗原長時間放置后仍可使用，這都是其優點。¹⁴C或³H標記的不足之處是操作較繁瑣，并難以獲得高比放射性的標記物；³H及¹⁴C放出的都是弱β射線，需用較昂貴的液體閃爍計數器方能獲得較高效率的測量，且測定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標記容易喪失免疫化學或生物學活性者，則仍以采用³H或¹⁴C標記物為佳。

表8-1 標記抗原常用的放射性同位素及其性質

　　大多數抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結構，往往容易損傷抗原的免疫化學活性；且放射性碘的半衰期較短，標記物放置后因衰變使放射性降低，因而需要經常制備標記物或要求能定期提供放射性碘標記都能適用，放射性碘放出γ—射線，用一般晶體閃爍計數器就能獲得較高效率而精確的測量，測量操作也很簡單。由于這些突出的優點，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘標記物*多。

　　從應用角度來看，¹³¹I和¹²⁵I又各有其優缺點，可根據實驗的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規格等條件合理選用。但相對而言，¹²⁵I有較多的優點，一是半衰期適中，允許標記化合物的商品化及貯存應用一段時間；二是它只發射28keV能量的X射線和35keV能量的γ射線，而無β粒子，因而輻射自分解少，標記化合物有足夠的穩定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對象（包括蛋白質、肽類、固醇類、核酸類以及環型核苷酸衍生物等）的標記，且操作簡單，一般實驗室都不難做到。

　　二、蛋白質與多肽激素的放射性碘標記

　　要制備高比度、高純度與免疫化學活性好的標記物，首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標記加網免疫分析的特異性，所以若用純度不高的抗原作標記，則標記后必須采取適當的步驟除去雜質，以獲得高純度的標記物。標記對象的純化應盡量采用溫和的方法，否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質（這時表面上活性可能還是良好的），再經標記反應時所受的損傷，活性就會顯著降低，影響以后的放射分析結果。有了好的純抗原，還要采用適當方法加以標記，盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學活性的標記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關鍵問題。

　　多肽激素與蛋白質多用碘標記，*常用的是¹²⁵I。碘化反應的基本過程如下：通過氧化劑的作用，使碘化物（¹²⁵I^-）氧化成的碘分子（¹²⁵I₂），再與多肽激素、蛋白質分子中的酪氨酸殘基發生碘化作用。所以不管采用哪一種放射性碘標記法，標記的化合物內部必須有碘原子可結合的基團，即結構上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質、肽類等抗原，在結構上含有上述基團的可直接用放射性碘進行標記。如不含上述基團的，放射性碘無法標記，必須在這些化合物的結構上連接上述基團后才能進行碘標記。

　　因此影響蛋白質、多肽碘化效率的因素，主要決定于蛋白質、多肽分子中酪氨酸殘基的數量及它們在分子結構中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反應條件（pH、溫度、反應時間等）及所用氧化劑的性質等也有影響。

　　常用的標記方法有：

　　（一）氯胺T法

　　氯胺T法標記效率高、重復性好、試劑便宜易得，是目前使用*多的碘標記方法。

　　1．原理氯氨—T（Chloramine－－T）是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環上羥基位的一個或兩個氫，使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。

　　2．方法以¹²⁵I—AVP的制備為例。

　　（1）碘化反應：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5）+¹²⁵1800μCi,混合后，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl（0.05mol/l PB, pH7.5）。迅速振蕩混勻，室溫下反應40s。

　　（2）終止碘化反應：加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl（0.05mol/l PB, pH7.5）,以終止碘化反應。

　　（3）Bio—Gel P₂層析純化：將碘化反應混合液注入Bio—Gel P₂柱，用0.1n HAC溶液洗脫，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。

　　（4）放射性測量：測定各收集管的放射性，出現兩個峰，峰為¹²⁵I—AVP，第二峰為游離碘鹽峰。個峰中計算的幾管，留下備用。

　　為了解標記抗原的質量，每次碘標記后應計算出碘的利用率，標記上多少放射性碘，以及每微克抗原結合上多少放射性碘。

　　（5）標記抗原的貯存：經純化與檢查后的標記物、加入1/8體積的異丙醇，分成若干小份，置于鉛罐中，在-20℃以下的冰箱中貯存備用，應避免反復凍融。標記抗原在貯存中是不穩定的，這是因為：一是脫碘，標記的碘從原來位置上脫落，變成游離碘；二是蛋白損傷、變性，成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明顯降低，標準曲線斜率變小，以致不能使用，故需分離純化，其方法是用Sephadex G100長柱（40～80cm ）過柱，洗脫后出現3個峰。第1個峰分子量大，是蛋白變性的聚合的大分子，尚保留部分抗原決定簇，免疫活性弱；第2個峰是純抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，免疫活性好；第3個峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個純抗原蛋白峰，其性能類似于新鮮標記的抗原。分離純化的方法解決了標記抗原的貯存、長期使用問題，特別對來之不易的抗原更顯得重要。

　　2．注意事項

　　（1）放射性碘源的選用：無載體的¹³¹I或¹²⁵I均可用于碘化標記，但應盡量選用新鮮的、比放射強度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強度≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運輸保存所需加入）量也增加，這將會顯著降低碘利用率及標記蛋白比放射強度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強度降低，另一方面因水的輻射化學產物增多（主要是¹³¹I源），都會降低標記時的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na₂S₂O₅等）量多時，會抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導致標記完全失敗。放射性碘源要用無載體的，標記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護和除污染，以及減少射線對蛋白質分子的損傷，標記投入的放射碘量不宜過大，一般以<5mCi為宜。

　　（2）放射性碘與多肽、蛋白質用量的比例：這比例對標記結果的影響很大。如上述原因，一般標記時放射性投入量不宜過多，示蹤實驗室中常規每次只用1～2mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質用量的比值主要靠標記時投入的多肽、蛋白質用量來控制。當投入的放射碘量一定時，多肽、蛋白質用量多（即I/多肽、蛋白質比值低），能獲得高碘利用率，但所得標記蛋白比放射強度低；相反多肽、蛋白質用量少（即I/多肽、蛋白質比值高），則碘利用率降低，但所得標記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動；而當此比值<1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標記多肽、蛋白比放射性也不會再增加多少。

　　（3）氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應時間：氧化碘化標記法中，會導致失活的*主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標記時氯胺T用量都比較大，或碘化反應時間較長，結果導致蛋白質結構和活性的嚴重損傷。氯胺T用量大，或長時間進行碘化反應，結果并不能使碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度提高多少，反而使標記多肽、蛋白活性下降。當用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時，試以各種蛋白質（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等）作微量標記，當氯胺T用量為20μg/0.1ml反應液、0～20^。C反應20s，碘利用率都已接近或達到峰，再加大氯胺T用量和延長反應時間是沒有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應增加，以達到預期的碘利用率，但決不應盲目加大氯胺T用量和延長碘化反應時間（通常反應時間不要超過1min），否則會導致標記多肽、蛋白質嚴重失活，不能用于實驗。當然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會使標記失敗。一般用¹²⁵I標記時，氯胺T用量要適當加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。

　　氯胺T用量減少了，Na₂S₂O₅用量也就可以隨之減少。為保證按時終止碘化反應，實驗時加入Na₂S₂O₅一般都是過量的。氯胺T用量大時，加入Na₂S₂O₅的剩余量也就會隨之增加，這就可能加重某些對還原劑敏感的蛋白質或多肽生物活性的損傷。為此，Na₂S₂O₅用量也不應過多。只要藥品沒有變質、試劑是新配的，以重量計算Na₂S₂O₅加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應（按反應克分子濃度計算，Na₂S₂O₅/氯胺T重量比約0.4），不要盲目加大用量，并應迅速將標記多肽、蛋白質從反應液中分離出來，以盡量減少多肽、蛋白質活性的損傷。

　　某些蛋白質或多肽對氯胺T較敏感，還可進一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應時間、降低反應溫度，以保護蛋白質的活性。這對一些較容易喪失活性蛋白質或多肽的碘標記十分重要。

　　（4）碘化反應體積：系指加入Na₂S₂O₅終止反應前液體的總量。碘化反應體積愈小，局部反應物濃度愈高，所得碘利用率和標記多肽、蛋白比放射強度就愈高。所以，標記應采用比放射標記效果。當反應液量少（<0.2～0.3ml）時，反應體積對碘利用率和標記多肽、蛋白質比放射強度的高低影響較大；當反應液量大（>0.5～1.0ml）時則影響較小。微量氯胺T法放射碘標記時，一般多控制碘化反應體積<100μl。

　　（5）碘化反應溫度：溫度升高，碘化反應速度加快，碘利用率有所增加。但總的來看，反應溫度的影響不很大，一般從0^℃到20℃碘利用率相差不過百分之幾，故一般在室溫下進行標記操作就可能獲得重復性好的結果。有些蛋白質或肽類極易喪失活性，則可在0℃進行碘化反應。

　　（6）碘化反應的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對多肽鏈的酪氨酸基苯環羥基鄰位的碘化作用，*適pH是7.3～7.8之間。當pH變化時，碘化位置也會發生變化，例如pH值較高時，組氧酸的咪唑環也可被碘化；當pH4～5時，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚，導致肽鏈斷裂。這些都會影響蛋白質或多肽的放射性碘化反應，或引起降解或失活。因此作放射性碘化標記時，除放射性碘源外，所有的試劑都應用適當的緩沖液配制，保證碘化反應在*佳pH條件下進行。

　　（7）微量蛋白質或多肽的吸附損失：界面的吸附損失，在使用大量蛋白質或多肽類時是可以忽略的，但作微量法標記時投入的蛋白質或多肽類只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附導致的損失就不能忽略。例如制備¹³¹I—ACTH時，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時，因表面吸附可損失10%～30%，甚至高達75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時，能減少吸附，但不能完全消除。一般殘留在反應管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%～8%、殘留在層析柱上折占5%～10%。殘留量隨標記蛋白比放射性強度而直線增減，殘留者幾乎全部都是標記蛋白。由此可見，微量蛋白質或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質、多肽會被顯著吸附而丟失，所以標記時投入蛋白質、多肽量過微（如<2μg）也是不適宜的，否則標記蛋白質、多肽的收回率會太低，并在計算上會造成較大的誤差。

　　（8）不同蛋白質、多肽碘化標記的差別：由于不同的蛋白質和多肽分子中含有的酪氨酸數目不同，而且其空間結構也不相同，分子中的酪按酸殘基有的容易發生碘化反應，有的就不容易碘化，因此同樣條件下進行碘化標記，不同蛋白質或多肽對碘的利用率是不相同的。不同蛋白質經碘化標記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素（GRH）、促黃體激素釋放激素（LRH）等多肽，碘化標記后容易喪失激素活性或與受體結合的活性；而AFP及人絨毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化標記，則較容易保存良好的免疫化學活性。

　　盡管不同多肽、蛋白度的碘化標記結果有所差別，但上述討論的因素對不同多肽、蛋白質碘化標記的影響有共同的規律。掌握了這些因素，就容易成功地獲得合格的標記物。

　　不同多肽、蛋白質的分子量大小、理化性質各不相同，放射碘化標記反應后，可根據具體情況采取不同的方法將標記蛋白質（或多肽）與未反應的游離放射性碘及受損傷的標記物分開，常用的方法有凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。

　　（二）乳過氧化物酶法（LPO）

　　本法反應溫和，對抗原、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應用。缺點是標記率較低，一般為20～40%。

　　1．原理此法是利用乳過氧化物酶（Lactoperoxidase）有促進微量過氧化氫對¹²⁵I^-的氧化作用，生成¹²⁵I⁺，并標記在多肽、蛋白質酪氨酸分子上。

　　2．方法以標記蛋白質抗原為例。

　　（1）反應液組成：蛋白質2～5μg溶于磷酸緩沖液10～25μl中，加入Na¹²⁵i 1m Ci（10μl）、乳過氧化物酶溶液25ng（10μl）、H₂O₂200ng（10μl）；

　　（2）在室溫保溫7min；

　　（3）加入H₂O₂200ng（10μl）；

　　（4）過7min再加入H₂O₂（3μl）；

　　（5）保溫7min后，加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應；

　　（6）10min后加入NaI載體溶液1ml ；

　　（7）按常規方法分離純化。

　　3．注意事項

　　（1）LPO質量好壞，可直接影響標記率，LPO應在使用前新鮮配制，以防酶活性降低。

　　（2）LPO用量應小于總蛋白質用量的1%，以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質。

　　（3）碘化反應速率分析表明，酶的催化速度很快。

　　（4）碘化反應在pH4.0～8.5較寬范圍內均可進行，*適pH值應依據蛋白質本身性質而定。

　　（5）H₂O₂應保持低濃度，如高于0.1mmol/L，對酶的活性將有抑制作用。

　　（三）Iodogen碘化法

　　此法具有標記率高、反應體積小（3ml水平）、可用低濃度的¹²⁵I原料、對多肽激素和蛋白質的免疫活性損失小、穩定等優點，系常規的碘化方法。

　　1．原理　用Iodogen為氧化劑，對蛋白質和多肽抗原進行碘化標記，把¹²⁵I直接引進分子中的酪氨酸殘基上。標記過程中被標記樣品不與Iodogen混合，標記后取出樣品即停止反應，不使用任何還原劑。

　　2．方法

　　（1）標記之前，先把Iodogen溶于有機溶劑，涂于管底，并使之干燥。

　　（2）標記時，將蛋白質溶液10～20μg/10μl（0.5mol/L,pH7.5PB）置于反應管中，反應管置于冰浴中。碘化時，¹²⁵I與蛋白質克分子之比例為1～1.2。反應時間在溫和的連續的攪拌下可達10min，從反應管中轉移出反應混合液，使其反應停止。反應液轉移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，層析分離前再放置5min，使其未標記的碘離子還原成分子碘，以避免在帶有緩沖液的柱中使白蛋白碘化。

　　3．注意事項

　　（1）涂有Iodogen的反應管，有氮氣中密封，并貯存在-20^℃條件下，至少可用3個月。打開管，使用時間很短。

　　（2）碘化反應時間，7min時標記率達，10min時略有減少。PH6.0～8.5時，標記率。

　　（3）Iodogen與蛋白質的比率是標記率的函數。的標記率是1克分子的Iodogen與8克分子或再多量之比。

　　（四）酰化試劑（Bolton和Hunter試劑）法

　　1．原理這個方法用酰化劑3－－（4-羥苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter試劑）做連接試劑，將¹²⁵I標記在羥苯基的2，5位置上，再將琥珀酰胺酯水解，通過一個酰氨鍵將3－－（4—羥基—5—¹²⁵I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。

　　2．方法¹²⁵I—Bolton—Hunter試劑可用氯胺T法自行制備，出已有該試劑的苯溶液作為商品出售。使用時取一定量的標記酯（μmol 蛋白用3～5μmol標記酯），用氮氣吹除苯，投入欲標記蛋白5～10μg及緩沖液10～50μl,pH8.0～8.5為宜，在冰浴中反應15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使過量標記酯消耗掉以終止反應。

　　此法避免了蛋白質與氧化劑的接觸，又避免了與放射性碘原子的直接接觸，可防止碘源中有害物質對蛋白質的損傷，適用于標記缺乏酪氨酸的蛋白質或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后會引起蛋白質的失活。其缺點是標記技術比較復雜，需要接觸較多的放射性，經二步反應，碘標記率比較低。一般認為此法不宜標記短肽，而適于分子量大于1萬的蛋白質。

　　三、放射性標記化合物的純化與鑒定

　　（一）純化標記化合物的常用方法

　　不論使用何種制備方法，要獲得合格的標記化合物，都必須將反應物經過仔細的分離、純化。另外，一些標記化合物，經過一定時間的存放后，往往會出現不純物，而需再純化。如碘標記生長激素（¹²⁵－－HGH）,在剛標記的第2天，從Sephadex G-100過濾譜上可見，幾乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1個月后，峰II組份減少，峰I和峰III成分明顯增加，峰I是集聚的標記生長激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化學雜質（圖8－－3）。

圖8－3　¹²⁵I—HGH的Sephadex G-100過濾譜

實線：新鮮制備的 125I—HGH　虛線：保存1個月的125I—HGH

　　標記化合物的純化方法，除制備比活度低而化學量又較多的標記物可用重結晶、蒸餾、萃取等常規方法外，一般需用微量分離技術，較方便的是層析法、離子交換法、凝膠過濾及高效液相層析法等。現以碘標記蛋白為例，說明以上各種方法的適用情況。

　　1．凝膠過濾法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P系列。分離標記蛋白與無機碘時，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100進一步純化。

　　2．離子交換法一般是制成離子交換層析柱，用于分離純化短肽標記物。

　　3．透析法　能將標記蛋白與小分子化合物很好地分離。

　　4．電泳法可用來分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質。

　　5．親和層析法利用蛋白質與其特異抗體或受體的結合來分離、純化標記蛋白質。此法特異性強，保持生物活性好，但操作較復雜。

　　6．高效液相層析法此法優點是分離效果好、快速，但需特殊設備。

　　7．伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一種植物凝集素，對糖蛋白有良好吸附能力，因此適于分離標記糖蛋白。吸附的標記糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脫。

　　（二）標記化合物的主要質量指標

　　作為示蹤劑及分析試劑的標記化合物，應具有比一般非標記化合物更高的質量要求。標記化合物的質量指標包括：放射性核純度、放射化學純度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及標記位置和定量分布情況等。

　　1．放射性核純度及其檢查方法

　　（1）放射性核純芳可用下式表示：

　　放射性核純度（%）=所需放射性核素的活度/樣品的總放射性活度×100

　　（2）放射性核純度的檢查方法：每一種核素都有它的特征，即物理半衰期及射線能量，故可通過半衰期及射線能量的測定來鑒別所需放射性核的純度。

　　①測定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用時間跟蹤法，每隔一定時間測量放射性一次，共測3～5個半衰期，以每次測得的放射性計數為縱座標，時間為橫座標，在半對數紙上作圖，并通過分析，可求出該放射性核素的純度。

　　②測定射線能量法：利用每一放射性核素的特征射線譜來檢查放射性核純度。γ發射體可用γ能譜儀，如檢測⁵⁷Co和⁵⁸Co的核純度：純β-發射體可用液閃儀，調節　道寬及淬火校正后，對如³H、¹⁴C、³²P的核純度進行測量；而β、γ混雜垓素，則用吸收法測量，如^99mrTc中母體雜質^99mMo的含量測量，是通過適當厚度的鉛屏蔽，將^99mTc 發射的能量為141ke V的γ射線減弱后，測定⁹⁹Mo發射的能量為739Kev 的γ射線。

　　2．放射化學純度及放化純度鑒定

　　（1）放射化學純度：放射性核素標記化合物都是以一定的化學形態存在的，所以：

　　放射化學純度（%）特定化學形態的放射性活度/樣品總放射性活度×100

　　放射化學純度受制備方法及原料的化學純度、產物存放條件等影響，一般放化純度控制在95%以上。

　　（2）放射化學純度的測定方法：原則是高效的化學分離與靈敏的放射性測量相結合。常用下列方法：

　　①放射層析法，又稱放射色譜法：本法是利用色譜技術使混合物中各組份分離，然后測定各組份的放射性活度。它具有選擇性高、分離效果好、操作簡便等優點，在放化純度鑒定中是一種重要的分析方法。*常用的是放射性紙層析法和放射性薄層層析法。

　　②放射性高效液相層析法：它對分離純化標記化合物及鑒定標記化合物的放化純度都有很大潛力，具有分析速度快、分離效率高、適用范圍廣等特點（幾乎80%的有機化合物均可應用）。關鍵是要選擇合適的固定相和流動相，使產品與雜質分離。在流動相中，被分析物各組份的濃度變化可用紫外或熒光檢測器檢測，而其放射性活度，可同時由放射性探測儀測定。放射性活度測定*簡單的一種辦法，是將洗脫液分部收集，然后在γ儀或液閃儀上進行測量；另一種較理想的是連續測量，在洗脫液流通池外包圍一個固體閃爍探頭，進行γ計數或在流通池前加一個三通混合室，用另一個泵混入閃爍液，測定軟β射線。可以與紫外控測器的掃描圖，同步描繪出放射性的分布圖。

　　③放射性核素反稀釋法：取一定量（W₁）已測定比活度（S_O）的標記化合物（約0.1～10mg），用>1000倍化學量（W₂）的純載體稀釋，充分混勻后反復純化到比活度恒定不變（Sp），此標記化合物的放化純度值應為：

　　有時該值>100%時，往往是由于所用載體化學純度不夠。因本法操作要求嚴格，一般不作常規放化純度鑒定用。

　　3．化學純度及化學量的測定標記化合物中的非放射性化學雜質雖一般不會對示蹤結果帶來直接干擾，然而這種雜質的含量越多對標記化合物在使用、存放過程中分解、變性的影響就越大。此外，也已發現某些標記化合物的化學雜質會給使用帶來直接影響。如用氚標記類固醇作放射免疫分析試劑，其中的化學雜質會影響標記抗原與抗體的結合率，使分析靈敏度降低。因此，對標記化合物的化學雜質含量，同樣必須加以控制。

　　要制得化學純度的標記化合物，是對可能產生的雜質加以防止。這要在冷試驗中解決。因為冷試驗所得產品是非放射性的，其化學純度可用常規方法，如溶點、沸點測定，NMR、紅外、紫外譜分析等手段加以鑒定，得到合格產品后，再按同樣方法及條件進行標記制備。

　　對于標記化合物的化學含量，則必需在標記反應及一定純化步驟后進行，由于需要高比活度的標記化合物，往往樣品的放射性很強，而化學量極微（如某氘標記化合物，分子量為300，每分子上標記2個氘原子，氘的同位素活度為99.8%，則理論上每25mCi（925MBq）的化學量還不足（130μg）,所以需用微量分析法才能測定其含量。一般而言，各種常規微量分析技術均可應用。目前大多用紫外分光、熒光光度等進行含量測定。

　　4．放射性比活度及其測定

　　（1）放射性比活度簡稱比活度，過去也稱比放射性。

　　比活度＝放射性活度／單位化學量

　　（2）比活度的理論值計算：每種放射性核素有一個比活度理論值，取決于該核素的半衰期和衰變常數。若N是1毫克原子（1mA）的總原子數，衰變常數λ（單位時間衰變的%），則

　　任何元素每1mA的原子數都相同，等于阿伏加德羅常數，即6.023×10²⁰個，故

　　若T1/2min為單位，則上式的活度單位為dpm/mA,進行單位換算后為：

　　根據上式，可計算出每種放射性核素比活度的理論值（常用放射性核素的比活度理論值見表8-2）。如果標記化合物每分子接上一個放射性核素原子，則以上原論值亦為該標記化合物的比活度（每毫摩爾的活度）理論值。

表8-2 一些常用放射性核素的比活度理論值

　　（亦即每分子一接一個該放射性核素原子的標記化合物的經活度理論值）

　　（3）放射性比活度測定方法

　　①直接測定計算法：將標記產品經分離純化后，配成合適的溶液，測定每毫升的放射性活度（如mCi/ml）及含量（μg/ml）從而計算其比活度。對于高經活度的標記物，化學含量甚低，一般需用光譜法，如紫外分光光度法測定其含量。

　　②層析掃描面積計算法：一般應用紙層析或薄層層析，將反應結果尚未分離的反應液點樣、展層，然后在掃描儀上描繪放射性分布圖，根據描繪的面積來進行計算，如圖8-4。

圖8-4　放射層析掃描面積計算比活度示意圖

₁為標記物峰面積：

S₂S₃為雜質峰及放射性原料峰面積

　　先計算標記率：

　　放射性比活度的計算：若投入的待標記物重量為W，且100%轉化為標記物，則比活度=A·Y/W，其中A為投入的總放射性。

　　如果層析掃描儀有紫外監測器和放射性活度計數率儀可同步測定掃描，則直接可給出比活度。

　　③自身取代計算法：這是間接測定標記物比活度的方法。所測定的標記物，需是分離純化后可用于RIA或RRA標記試劑。

　　方法的原理是：作一條常規的RIA（或RRA）標準曲線，另作一條不加非標記標準品，只加抗體和不同量標記試劑的自身取代曲線。兩者用同一種抗體，且抗體用量完全相同。若反應平衡后測定結合部分的放射性，掏算成所加總放射性（注意：對標準曲線總說總放射性各管相同，對自身取代曲線來說各管不同，需分別換算）的百分數，即結合率B。由于兩條曲線所用抗體的質和量嚴格相同，標記物與非標記標準品與抗體親和力也相同，故B的大小就完全取決于各管中標記物和非標記標準品的總量。亦即若從兩標準曲線上取一點相同的B，則

　　（標記物+標準品）_標準曲線=（標記物）_{自身取代曲線}

　　故由此便可直接計算標記試劑的化學含量并進一步求得比活度。為求準確度高，可取我點B求出平均比活度。

　　用自身取代法測定標記化合物的比活度，只適用于RIA的標記抗原及受體的標記配基。使用時應注意：①標記物與未標記物對抗體（受體）的親和力應相同；②非特異性結合應較小，且計算時應扣除；③制備標準曲線與自身取代曲線時，操作步驟應相同，特別是B與F分離的條件要一致。

　　5．生物活性、免疫活性測定

　　（10）生物活性、免疫活性測定的重要性：放射性標記化合物作為示蹤劑用于生物體內的示蹤研究，或作為分析試劑用于生物活性物質分析，都要求標記化合物不改變其原有的生物活性和免疫活性。當給化物引入放射性原子，即使“同位素標記”大多需經過原子交換或化學反應及分離純化等物理化學處理，有可能造成光學構型及立體構型的改變而使標記物改變性質。“非同位素標記”，如蛋白質分子中引入碘原子，則更易引起蛋白質失活、變性。故測定放射性標記化合物的生物活性和免疫活性，對保證使用效果十分必要。

　　（2）生物活性和免疫活性測定的要求：需根據使用要求而定，因為同一標記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關；同一標記激素，其與受體結合能力的改變與抗體結合能力的改變也不一定平行。

　　（3）測定方法：測定標記蛋白質或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種：

　　①物理化學方法：可用電泳法、吸附法及凝膠過濾法等物理化學方法來測定標記蛋白質的結構改變情況，如標記后受損全傷的蛋白質在電泳時泳動性減少，碘化受損的多肽激素在血紅蛋白涂碳上的吸附性質也有改變，而蛋白質變性聚合時大分子聚合體將在凝膠過濾時不停留在凝膠柱上。這些測定雖較快速方便，但對標記物的生物活性和免疫活性的嚴格判定來說，還是很不夠的。

　　②特異結合試驗：根據放射性標記化合物用于放射免疫分析等不同要求，分別與其相應抗體或受體進行特異性結合試驗。以放射免疫分析試劑為例，測定其免疫活性的方法是：先觀察標記物與抗體的結合率，如果結合率高，說明抗原的免疫活性較好。進一步觀察標記抗原與非標記對抗體親合力是否一致，做法是用不同稀釋度的抗體，分別與標記抗原及與標記抗原加非標記抗原的混合物進行特異結合，其中混合物抗原總濃度要和單獨使用放射性抗原的濃度相同。如單獨使用標記抗原1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標記抗原為0.1ng，非標記抗原為0.9ng，比較兩者的結合率，如果基本相同，說明標記抗原保持其原來的親和力，在標記等操作過程中未受到明顯損傷。如圖8-5中，A線與B線基本平行；如果標記抗原免疫活性已有降低，則如C線所示。

圖8-5　標記蛋白的免疫活性測定

　　A；為標記抗原與血清的滴度曲線B：為非標記抗原（加入少量標記抗原）的滴度曲線；C：與A相同，但標記抗原免疫活性已有降低

　　③生物特性測定：如¹²⁵I—纖維蛋白原，可用凝血酶測定其可凝能力，與非標記物相比，視是否有改變。使用何種生物特性測定，根據標記物的生物性質而定。另外，上述特異性結合試驗，如果受體作異結合劑，也是檢驗用作RRA或RBA分析試劑的標記物生物活性情況的有效方法。

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第三節　結合和游離部分的分離

　　放射免疫分析時加入的抗原和抗體的量極微，反應所形成的復合物并不能成為肉眼所能辨認的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必須分別測量與抗體結合的（B）和游離的（F）抗原，所以，B、F的分離是放射免疫分析中的一個重要環節　。根據抗原—抗體復合物與游離抗原理化性質或免疫學性質的不同，可采取各種分離技術。

　　一、對分離方法的要求

　　分離方法的選擇直接影響分析的質量，通常需滿足以下要求：

　　①使B和F分離完全；②不受外界因素的干擾而影響分離效果；③與游離抗原的非特異性作用盡可能小；④操作簡便，分離迅速，重復性好，適用于大量樣品分析；⑤來源廣，價格低廉，便于使用，適合RIA技術自動化。

　　二、常用的分離方法

　　目前用于放射免疫測定中的分離方法很多，各有其優缺點，下面介紹幾種常見的分離方法：

　　（1）吸附分離（固相顆粒）

　　活性碳吸附劑（目前常用）

　　硅鎂吸附劑（滑石粉等）

　　交換樹脂吸附劑

　　（2）蛋白沉淀劑

　　硫酸銨、硫酸鈉

　　聚乙二醇（PEG）（目前常用）

　　無水乙醇、丙醇等

　　（3）免疫分離劑（第二抗體）

　　（4）磁性分離劑

　　磁化活性碳吸附劑

　　磁化固相抗體

　　（5）固相包被分離法（固相分離劑包被在測試管內）

　　（一）吸附分離法

　　這種吸附分離劑是固相顆粒，它可以從反應液中吸附游離抗原。

　　活性炭是常用的吸附劑。活性炭多用于小分子游離抗原和抗原—抗體復合物的分離。具體應用時在活懷炭顆粒的表面涂上一層右旋糖酐或蛋白類化合物。這樣活性炭末的表面構成一定大小的孔洞，在反應液中加入這種特殊顆粒的混懸液時，小分子的游離抗原被活性炭吸附，達到分離B與F的目的。

　　活性炭吸附方法的優點是操作簡便、價廉，缺點是離心沉淀部分是F而不是B，不適用目前自動化放免測定，分離時易受溫度和時間的影響。

　　（二）沉淀分離法

　　沉淀分離法的原理，是鹽類或有機溶劑能夠破壞蛋白質分子表面的水化層而發生沉淀（這種分離要求蛋白質分子處在等電點環境中）。常用的沉淀劑是聚乙二醇（PEG）。PEG是一種直鏈大分子聚合物，使用PEG溶液時分離沉淀是在有載體血清蛋白或丙種蛋白存在，而且要求γ球蛋白的*終濃度達250mg/ml以上的情況下才能實現。PEG沉淀的結果易受過量的脂類或離心溫度的變化影響，PEG離心溫度在20^℃以下進行。PEG沉淀的優點是PEG價格低廉，操作簡便，一次可處理大量樣品。其缺點是PEG單獨使用時非特異結合高，所以常與其它方法聯合使用；其分離效果易受pH、溫度等影響。

　　（三）雙抗體分離法

　　雙抗體分離法也稱免疫分離法，是特異性分離，應用十分普遍。本法是以抗IgG抗體和可溶性的抗原-抗體復合物結合，形成很大的復合物而沉淀。很多抗原的特異抗體來自家兔或豚鼠，稱為抗體，形成的復合物不能通過離心將其沉淀。或將抗體的同種正常動物的血清IgG免疫另一種動物所制得的抗體為第二抗體，該抗體與抗體形成不可溶的復合物，經離心可將其沉淀，從而達到分離的目的（圖8-6）。

圖8-6　雙抗體法分離原理模式圖

　　第二抗體分離的優點是重復性好，B和F分離較為完全，非特異結合低，可同時處理大量樣品，使用方便。缺點是分離時間長，非特異性結合可有較大的波動，第二抗體用量較大。

　　（四）磁性分離法

　　1975年，Hersh報道了用磁化分離技術分離血清狄高辛放免測定的B、F后，受到了廣泛的重視。近年來國內外許多學者對磁化顆粒的制備進行了系統地研究，應用于B與F的分離，并取得了引人注目的進展，使放免的B、F分離不再使用離心，縮短了放免操作時間，便于放免自動化測量。磁性分離的具體原理為血清樣品與標準品中的抗原與磁顆粒上的一定量的抗體反應，產生的抗原抗體磁性顆粒復合物，在磁場作用下沉降，使結合部分與游離部分分離。在磁性分離器上棄上清，進行測量。優點是簡化了操作程序，B、F分離也較完全，穩定性好。

　　目前常用的磁性分離技術除磁性固相抗體外，還有磁化活性炭吸附分離劑。

　　（五）固相包被分離法

　　近年來由于固相技術的研究使其固相所被（埋）技術發展迅速，再有固相包被具有簡便、快速、穩定、不需離心等優點，有逐漸取代液相法的趨勢。

　　1990年，Causse報告了活化塑料管新技術及生物素結合抗體、親和素標記物的應用，使放免技術對多數微量物質的檢測可達到10^-15g級水平，大大提高了放免測定的精確度、靈敏度。

　　抗體包被：物理吸附法—方法簡便，但包被量低。

　　價鍵結合法—需要纖維素、瓊脂等固相載體，操作復雜。

　　Causse活化塑料管新技術，提高了包被量，主要特點是將順丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚體涂布試管，在試管壁形成一層活性薄膜（這種方法操作簡便）。

　　（六）雙抗體+PEG的分離法

　　這種分離方法利用雙抗體特異性強、PEG沉淀簡便快速的優點，從而克服了雙抗體時間長、PEG方法非特異結合高的缺點。這一方面是當前分離技術中較理想的一種方法。

　　這種聯合方法分離方法減少了第二抗體的用量，PEG的*終濃度也只需2～4%，成本較低。這種方法既適用于蛋白質、酶、大分子物質，又適用于小分子肽等半抗原物質。

　　1991年，北京中國同位素公司北方免疫試劑所采用80年代法國廣泛應用的雙抗體+PEG、再加一定劑量的γ球蛋白（免疫第二抗體時應用的γ球蛋白）的分離劑，溶解于磷酸緩沖液中，pH在7.4左右。這種分離劑推廣應用產生了很好的效果。沉淀完全，牢固，而非特異性結合低，時間短（加入分離劑15min后即可離心），受溫度影響小，受到用戶的廣泛好評。

　　以上方法，要依據反應液中反應物分子量大小，酸堿度等特點，選擇合適的分離方法及分離劑。

第四節　樣品的前處理

　　樣品的正確收集與處理，是蛋白質及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的樣品與測定項目，其前處理有不同的要求。下面以神經肽測定為例，介紹樣品的前處理方法。

　　一、腦、脊髓與垂體中神經肽的提取（以大鼠為例）

　　1．大鼠稱重后，在盡量安靜的情況下，迅速斷頭、取軀干血。

　　2．盡快取下全腦、脊髓（某段）與垂體，在沸生理鹽水中煮5min，以滅活酶，保持神經肽的穩定。

　　3．根據實驗要求分出腦區（如小腦、橋延腦、下丘腦、中腦或中央灰質、丘腦、皮層、海馬、紋狀體等與垂體前葉。

　　4．腦區等稱重。

　　5．把腦區、垂體或脊髓，分別置于玻璃勻漿管內，加入1mol/l HAC（或HCl）1ml，充分勻漿后倒入塑料指形管中，在室溫下放置100min，使生物活性物質充分溶解在酸中。

　　6．加入1mol/l NaOH 1 ml，中和酸。

　　7．離心，取上清。

　　8．低溫（-20^℃以下）保存待測。

　　二、大鼠腦神經核團微穿孔取樣方法（以下丘腦為例）

　　1．大鼠迅速斷頭，取出全腦，置沸生理鹽水中煮5min。

　　2．將全腦置于取材角度器上，分別于視交叉前和乳頭體后用雙面刀片垂直切斷，取下丘腦塊。

　　3．將雙面刀片裝在切片機上。

　　4．將下丘腦置于切片機機載物臺上，腹側向下，并用502膠水固定。在腦塊后方適當放置瓊脂塊以利固定。

　　5．開動振動切片機，緩慢移動推進器，切片厚400～500μm。用毛筆沾生理鹽水，小心收集切片置于平皿內的生理鹽水中。

　　6．將腦切片平置于橡皮板上，并在體視顯微鏡下，參照鼠腦立體定位圖譜，確定神經核團位置。

　　7．選擇相應直徑的穿孔器，分別于兩側核團上垂直插下，然后推出針蕊將所取核團組織放入勻漿器中。

　　8．加入1mol/l HAC 0.5ml, 充分勻漿后倒入放免測定管中，放置100min。

　　9．加入1mol/l NaOH 0.5ml中和酸，離心（3000rpm/min）20min，取上清液，低溫保存待測。

　　三、內臟、腫瘤組織中神經肽的提取（以胃粘膜為例）

　　（1）取下胃粘膜后，迅速稱重置于試管，中沸蒸餾水1ml，在水浴中煮100min。標本在室溫下放置，其中的生物活性物質會被酶降解，所以要立即加熱處理。

　　（2）冷卻后倒入特殊的勻漿器中，充分勻漿（使用電動攪拌器）。勻漿液倒入塑料指形管中，再用蒸餾水1ml，沖洗勻漿器，并倒入上述管中。

　　（3）離心，取上清，低溫保存待測。

　　四、血漿

　　1．直接測定

　　（1）加酶抑制劑：準確采全血若干毫升，注入預冷的加有①抗凝劑0.3mol/l EDTA·2Na（乙二胺四乙酸二鈉）溶液（每毫升全血20μl）、或1%肝素（每毫升全血10μl）；②抑肽酶（每毫升全血500單位）的塑料指形管中，迅速低溫離心，取血漿低溫保存待測。

　　抑肽酶有液體的（標簽寫的有每毫升含多少單位）與固體的（每毫升含12TIU，1TIU=900KIU，即每毫克含10800單位）。固體的抑肽酶可用生理鹽水溶解，使之每20μl含500單位。

　　（2）酸化處理：每毫升血漿加1mol/l HCl 0.2ml，低溫保存待測。測定前加1mol/l NaOH 0.2ml。

　　以上兩種方法，任選一種即可。

　　2．間接測定血標本經提取后，可去除蛋白質等干擾因素，并使微量的生物活性肽濃縮，但較費時，成本也高。常用的提取方法有：

　　（1）柱層析提取法：有多種層析柱可供提取不同的神經肽，其中較為方便的是用Sep-pak C₁₈層析柱提取。主要步驟步：

　　①柱的預處理：該柱有兩頭，長頭連接注射器，可注入溶液與樣品，短頭為排出口。預處理時注入乙腈10ml。蒸餾水20ml，使柱中的生物膠活化。

　　②注入樣品（如血漿、腦脊液、腹水、尿等）：樣品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及雜質等吸附在生物膠上。血漿上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用時間。]

　　③淋洗：用4%HAC溶液100ml注入柱中，以洗去一些雜質。

　　④洗脫：用7ml酸性乙腈（按容積算，每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸餾水21ml）作為洗脫劑，注入柱中，把生物活性肽洗脫下來，收集在塑料指形管中。

　　⑤清洗：用乙腈、蒸餾水清洗柱子，以備后用。

　　⑥將洗脫液吹干，低溫保存待測。測定時可加入一定量的緩沖液溶解。

　　Sep-Pak C₁₈柱層析，也可用于制備標記抗原時的層析純化。

　　（2）加膜藻土提取法：

　　①抽血：用一次性塑料注射器抽取受試者靜脈血4ml，置于加有肝素（125單位/ml 全血）指形管中。

　　②分離血漿：在4^℃下離心，取出血漿。

　　③血漿酸化：取2ml血漿，加入1mol/l HCl 0.5ml, 搖勻。

　　④吸附：加入0.5%藻土懸液2ml，在水平震蕩器上震30min。離心，去上清，留沉淀。

　　0．5%藻土縣液（Fuller’s earth）的配制：

　　0.5g Fuller’s earth

　　0.1g Dextran T₇₀

　　100ml去離子水

　　⑤洗脫：在沉淀管中加入80%酸性丙酮1ml，在漩渦振蕩器上振2min，離心，取上清置于經硅化的玻管中。

　　80%酸性丙酮的配制：

　　80ml丙酮

　　20ml 1mol/L HCl

　　⑥去脂：加入石油醚1ml，搖勻，脂肪溶解在石油醚中，分層后吸去上層。

　　⑦干燥：下層液體，置于37℃水浴中，用氮氣（或空氣）吹干。

　　⑧低溫保存待測。測定時用一定量緩沖液溶解。

　　（3）有機溶劑提取法：常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。將溶劑按一定比例，加入標本內，混勻、振蕩、離心，取上清吹干，冷藏待測。通常在有機溶劑中加入適量的酸。

　　在這些方法中，以柱層析法*穩定、準確，但成本高，推廣不易。加膜藻土法，提取率較高，但操作復雜、費時。有機溶劑提取法操作方便，成本也低，雖穩定性較差。

　　五、腦脊液

　　1．煮沸收集腦脊液時，管子浸在冰水中。收集完畢，立即在沸的水浴中煮5min。離心、取上清；低溫保存，待測。

　　2．酸化在1ml腦脊液中加入1mol/l HCl 0.2ml；測定時，再加入1mol/l NaOH 0.2ml中和。

　　3．加酶抑制劑

　　4．柱層析提取

　　以上方法，任選一種。

　　六、尿

　　尿液收集于事先加有適量醋酸或鹽酸的容器中，使pH達4左右，煮沸1～2min，冷卻后離心，取上清，加適量NaOH液，使尿液pH達7.0左右。此尿即可用于直接測定或經提取后再測定。

　　尿認提取法相同。采用Sep—Pak C₁₈柱層析提取較為方便，因尿中不含蛋白，柱子可多次使用。

　　七、胃液

　　抽取胃液，注入加有抑肽酶的管中，離心，取上清，低溫保存待測。

第五節　放射免疫分析法的建立

　　一、放射免疫分析的基本試劑

　　（一）標準品

　　標準品是放射免疫分析法定量的依據，由于以標準品的量用來表示被涮物質的量，故標準品與被測物質應當化學結構一致并具有相同免疫活性。標準品作為定量的基準。應要求高度純化。標準品除含量應具有準確性外，還應具備穩定性，即在合理的貯存條件下保持原來的特性。

　　按實驗要求，將標準品用緩沖液配成含不同劑量的標準溶液，用于制作標準曲線。

　　（二）標記物

　　標記抗原應具備：①比放射性高，以保證方法的靈敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡可能長，標記一次可較長時間使用，這對來之不易的抗原尤其重要；④標記簡便、易防護。

　　要準確測量B與F的放射性，必須有足夠的放射性強度。所選用的標記抗原的量，在使用¹²⁵I時達5000～15000cpm。

　　（三）抗體

　　應選擇特異性高、親和力強及滴度好的抗體，用于放射免疫測定。

　　根據稀釋曲線，選擇適當的稀釋度，一般以結合率為50%作為抗血清的稀釋度。

　　（四）B與F分離劑

　　以2%加膜活性炭溶液為例，2%加膜活性炭溶液的配制：

　　活性炭2g（杭州木材廠生產，森工牌732型）

　　右旋糖酐T₂₀0.2g

　　加0.1mol/L PB 至100ml

　　電磁攪拌1h，然后置于變通冰箱冰箱待用。

　　（五）緩沖液

　　放射免疫分析技術所用的緩沖液有多種，要通過實驗選用抗體和抗原結合的緩沖液。

　　目前*常用的緩沖液有下列幾種：①磷酸鹽緩沖液；②醋酸鹽緩沖液；③巴比妥緩沖液；④Tris –HCl緩沖液；⑤硼酸緩沖淮。其中以磷酸鹽緩沖液應用*多。

　　在緩沖液中，除必須有弱酸及弱酸的鹽成分外，還應根據不同檢測項目加入下列物質：①保護蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明膠，濃度為0.1%～0.2%，用以降低試管對抗原的非特異性吸附。②防腐劑：多采用0.1%疊氮鈉、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制劑：如測定心鈉素等肽類激素時，要加入適量的抑肽酶，用以抑制血漿內源性水解酶對待測物的降解；又如測定cAMP、cGMP時，需加入EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻斷劑：在測定甲狀腺激素或測定某些甾體激素時，必須加阻斷劑，使和蛋白質相結合的激素，變為游離型。常用的阻斷劑有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水楊酸鈉、三氯醋酸鈉等。⑤載體蛋白：采用二抗作B與F分離劑時，要向反應液中加入適量與抗體同種動物的正常血清。在測定不含有血漿蛋白的樣品時，用PEG沉淀劑分離B、F，必須加適量γ球蛋白或正常人混合血清。

　　在神經肽的RIA時，常用PELH緩沖液，（按1000ml,pH7.6）：

　　0．1mol/l PB　　　　　　　　980.0ml

　　0.3mol/L EDTA·2Na　　　　　10.0ml

　　0.2%洗必泰溶液　　　　　　　10.0ml

　　溶菌酶　　　　　　　　　　　1.0g

　　二、加樣程序

　　由于抗原、標記抗原和抗體三者加樣次序不同，而出現兩種加樣程序，分述如下：

　　（一）平衡飽和加樣程序

　　1．基本原理所謂平衡飽和，是指抗原和抗體反應達到再不結合，也不解離的平衡狀態，稱為飽和狀態，即平衡飽和。所以，有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測抗原、標記抗原、抗體三者一起溫育。

　　2．加樣程序一般先加標準物或被測樣品，再加抗血清，*后加標記物。這樣的順序是讓標準物或被測物與抗體有短暫的結合，提高抗原的競爭抑制能力。

　　在小分子半抗原的放射免疫分析中，標記抗原和未標記抗原與抗體結合的親合力常常是不相同的，前者比后者的親合力高。因此，上述加樣程序就更有必要，所以一般都采用先加標準物或樣品和抗血清，后加標記物。這樣測定也比較穩定。

　　在大分子蛋白質抗原的放射免疫分析中，如果是雙抗體分離法，抗原和標記抗原與抗體三者加樣，可不分先后，有的是標準物、標記物、抗血清的加樣順序，但一般習慣還是標準物或血樣、抗血清、標記物、然后混勻溫育24～48h，再加雙抗體，繼續溫育24h，使免疫反應達到平衡。對一些多肽激素的放射免疫分析，應用雙抗體分離法，其流程比較長，這樣的順序同樣可不分先后。

　　以大鼠垂體、下丘腦β-內啡肽RIA測定程序為例：

　　（1）加樣（單位μl；總反應體積500μl）

　　（2）孵育：4℃，24h

　　（3）分離B與F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，搖勻，立即離心，去上清，測沉淀（F）的CPM數。

　　（二）順序飽和加樣程序

　　1．基本原理先將標準物或血樣品與抗血清混勻，免疫反應6～24h，使抗原與抗體充分結合，甚至達到平衡，然后再加入標記抗原，與抗體反應12～24h，*后分離B與F，這稱為順序飽和分析法。

　　應用順序飽和加樣，可以提高測定方法的靈敏度。Utiger在做人促甲狀腺激素（TSH）放射免疫分析時，將標記物延至第2天加入，發現其靈敏度增加兩倍。如果縮短*后的溫育時間，仍可取得滿意的結果。所以一般認為，在順序飽和加樣中，第1次溫育時間可以長，而第2次溫育時間要短，這樣可以提高靈敏度。但也有相反的意見，認為順序飽和加樣，是使用過量抗體，會使靈敏度受到一定影響。如果使用抗體不過量，溫育時間縮短，在抗原和抗體結合未達到平衡飽和時就加入標記物，這樣既不影響加靈敏度，反而比較穩定，甚至可提高靈敏度。

　　2．加樣程序　以人血漿精氨酸加壓素RIA測定程序為例（直接測定）。

　　（1）加樣（單位μl；總反應體積600μl）

　　（2）孵育：4^℃，24h。

　　（3）分離B與F。

　　無肽血漿，用于血漿的直接測定。其制備方法為：在電磁攪拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共兩管，離心、去上清。血漿5ml，倒入上述活性炭管中，加蓋，充分振蕩10min，離心，上清倒入上述另一活性炭管中，振蕩10min，再離心，取上清，即無肽血漿。血漿中的生物活性物質被活性炭吸附而去除。

　　（三）計數、繪制標準曲線與測定樣品含量

　　以活性炭分離B與F，沉淀計數是F的cpm。T—F—NSB，得B的cpm數。

　　計算標準管與樣品管結合（B）的cpm數及與零標準管結合（B₀）的比（B/B₀×100%）。

　　用半對數紙，以標準管的B/B₀為縱座標，以各標準管含量為橫座標，繪制標準曲線。

　　根據樣品的結合率（B/B₀×100%），從標準曲線中找出被測樣品抗原的含量，再換算成每毫升血漿含某抗原的量，或每毫克（組織濕重）含某抗原的量。

　　三、放射免疫分析的質量控制

　　（一）質量控制的目的和內容

　　放射免疫分析的質量控制實際上就是控制測定誤差，監督測定結果。它包括兩方面的內容：一方面對測定結果做精確分析；另一方面鑒定常規測定方法，對那些測定結果不好的方法加以改進，并建立新的測定方法。質量控制分四個方面：

　　1．在一個測定方法內產生的誤差。

　　2．在同一實驗室內不同方法之間產生的誤差。

　　這兩種情況屬于內部質量控制。

　　3．用同一測定方法，在各實驗室之間產生的誤差。

　　4．采用不同方法，在各實驗室之間產生的誤差。

　　后兩種情況屬于外部質量控制。

　　（二）放射免疫分析中造成測量誤差的因素

　　誤差包括系統誤差和隨機誤差。系統誤差發生在測量過程中由于儀器不準、試劑不純、標準品不穩定等原因，使測定結果呈傾向性偏大或偏小，這種誤差應力求避免。隨機誤差是測量過程中各種偶然因素造成的，沒有固定的傾向性，這類誤差是不可避免的，必要時做統計學處理。

　　造成誤差的可能來源有以下幾個方面：

　　1．各種儀器：設備的準確性、穩定性、效率以及被污染等情況帶來的誤差。如：①由于放射性測量儀器的穩定性、效率、樣品試管的材料和均勻性及被測物的放射性強度等原因。②由于樣品的自吸收，本底校正，測定時間，可能的污染等原因。③在試驗室中所有的移液管、微量取樣器以及天平的刻度、校準和使用方法等原因。④由于反應試管、移液管以及測定用試管等表面清潔度和所引起的不同吸附等原因都可以對測定結果帶來誤差。

　　2．試劑的純度、質量和穩定性的影響也是造成誤差的重要因素。如標記抗原的比度、純度，輻射自分解，抗體的穩定性，分離劑、阻斷劑及緩沖液等試劑的純度等。

　　3．在放射免疫分析中一些基本操作，如取樣、提取、沉淀、分離以及保溫條件不適當等造成的誤差。由于工作人員熟練程度不同也常常帶來誤差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹氣與不吹氣等。工作人員草率、不按規程操作等也都可以造成誤差。

　　4．樣品誤差。樣品的收集方法、貯存溫度、放置條件，微量樣品取樣的準確度，樣品可能造成的污染以及樣品的變性（如免疫反應活性的降低、蛋白質的變性等）也都能造成測量的誤差。

　　5．提取及層析分離過程中的丟失。

　　（三）放射免疫分析中測量誤差的控制

　　1．選擇準確性高的方法：對各種方法進行比較，淘汰粗糙及難以重復的方法。

　　2．建立方法對比。用相同的測量方法和不同的測量方法在同一實驗室和不同實驗室，在同一地區和不同地區，在同一時間和不同時間，對同一樣品進行對比，檢查產生誤差的原因。

　　3．建立各種類型的標準。對標準品應規定純度及制備方法，使用年限及貯存條件。

　　4．建立操作規程，按章　操作。對使用的試劑、儀器設備要經常檢查其有效性，更換試劑時應進行必要的鑒定，必要時對測定方法要做重復性試驗和回收試驗。

　　5．建立可靠的檢查制度。經常對測定結果進行核查，利用控制血清、標準血清檢查每批結果的準確性。